[發明專利]一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母及構建方法

在審

• 申請號: 201710467627.1
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107841469A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 曹遠東;潘烘;周志;周華嬌;張燕;焦賀勛
• 申請（專利權）人: 江西嘉博生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/66;C12N15/12;C12R1/645
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 謝德珍

技術領域

本發明涉及一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母及構建方法。

背景技術

抗菌肽是一種小分子短肽，具有廣譜抗菌性， 一般由小于 60 個氨基酸殘基組成，由于分子量小，因此可以在水中溶解，高溫下不易分解， 抗菌肽是在誘導條件下，動物免疫系統產生的一類防御性肽類物質，是免疫防御系統的重要組成部分。

PF1最早是科研人員從豬小腸中發現的，是 Cathelicidin 抗菌肽家庭中富含精氨酸和脯氨酸的線狀抗菌肽，分子量約為 9KDa，主要含 42 個脯氨酸殘基和 15個苯丙氨酸殘基，是一種高抗菌活性，相對穩定的抗菌肽。

發明內容

本發明其目的就在于提供一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母及構建方法，使用乳酸克魯維酵母對豬小腸抗菌肽 PF1進行表達，同時表達產物分泌胞外，降低了后續的分離純化成本。

為實現上述目的而采取的技術方案是，

一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母，所述重組乳酸克魯維酵母為PF1-pKLAC2-GG799。

一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母的構建方法，包括如下步驟：

（1）按乳酸克魯維酵母密碼子優化合成豬小腸抗菌肽PF1基因；

（2）將豬小腸抗菌肽PF1基因與乳酸克魯維酵母質粒pKLAC2同時雙酶切反應、瓊脂糖凝膠電泳回收，并進行4℃過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌JM109，提重組質粒PF1-pKLAC2；

（3）使用限制性內切酶SacII線性化處理重組質粒；

（4）線性化重組質粒轉化乳酸克魯維酵母 GG799,構建重組乳酸克魯維酵母PF1-pKLAC2-GG799。

有益效果

與現有技術相比本發明具有以下優點。

本發明的優點是使用乳酸克魯維酵母對豬小腸抗菌肽PF1進行表達，同時表達產物分泌胞外，降低了后續的分離純化成本，因此具有更廣闊的應用前景。

附圖說明

以下結合附圖對本發明作進一步詳述。

圖1為豬小腸抗菌肽 PF1 基因與 pKLAC2 質粒連接的陽性轉化子 PCR 鑒定電泳圖（引物 PF1-F 和 PF1-R，產物約 267bp）；

圖2為乳酸克魯維酵母 GG799 表達 PF1 的 SDS-PAGE 圖（蛋白大小在 9KD 左右）；

圖3為 pKLAC2 質粒圖譜；

圖4為 pKLAC2 質粒的多克隆位點圖譜。

具體實施方式

一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母，所述重組乳酸克魯維酵母為PF1-pKLAC2-GG799。

所述基因的乳酸克魯維酵母質粒pKLAC2。

所述質粒的乳酸克魯維酵母為GG799。

一種表達豬小腸抗菌肽PF1基因的重組乳酸克魯維酵母的構建方法，如圖1-4所示，包括如下步驟：

（1）按乳酸克魯維酵母密碼子優化合成豬小腸抗菌肽PF1基因；

（2）將豬小腸抗菌肽PF1基因與乳酸克魯維酵母質粒pKLAC2同時雙酶切反應、瓊脂糖凝膠電泳回收，并進行4℃過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌JM109，提重組質粒PF1-pKLAC2；

（3）使用限制性內切酶SacII線性化處理重組質粒；

（4）線性化重組質粒轉化乳酸克魯維酵母 GG799,構建重組乳酸克魯維酵母PF1-pKLAC2-GG799。

實施例 1

PF1基因的獲得

抗菌肽PF1的氨基酸序列為：

AFPPPNVPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFP

按乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優化，兩端分別添加酶切位點 NcoI 和EcoRI及酶切位點保護性堿基， 并在上游添加 6 個組氨酸的核苷酸序列，優化好的序列為：