[發明專利]一種褐藻膠裂解酶及其應用

在審

• 申請號: 201710467180.8
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107287179A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 王學江;李峰;張志凱;遲艷
• 申請（專利權）人: 五洲豐農業科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 煙臺雙聯專利事務所(普通合伙)37225
• 代理人: 梁翠榮

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一株褐藻膠裂解酶基因及其應用。

背景技術

我國擁有廣闊的海域面積，其中蘊含著豐富的海洋生物資源，尤其是海藻資源。褐藻主要包括海帶、裙帶等，其細胞壁中富含的褐藻膠是一種直鏈酸性多糖，在天然狀態下，褐藻膠的主要存在狀態為水溶性的褐藻酸鈉(sodium alginate)、褐藻酸鉀等褐藻酸鹽類和水不溶性的褐藻酸(alginic acid)。目前市場上的褐藻酸鈉(商品名為海藻酸鈉)或其他褐藻酸鹽主要是從褐藻中獲得。研究發現降解褐藻酸鈉所得到的寡糖具有多種生物活性，比如免疫調節、促生長、誘導植物抗性和提高蛋白質穩定性等，因而可廣泛應用于化工、農業、食品、飼料添加和醫藥等領域(劉航,天然產物研究與開發,2012,24:201-204)。褐藻酸鈉可用多種方法降解，包括化學降解法、物理降解法和酶降解法?；瘜W降解法以酸降解為主，但該方法降解條件難以控制，操作較復雜，耗時長。物理降解法包括輻射法和超聲法等，一般與其他降解法一起使用，降解產物的極限分子質量為50kDa左右，不易制得寡糖。而用褐藻膠裂解酶降解褐藻酸鈉具有降解條件溫和，得率高等優點，且因為酶的底物專一性，能為后續研究寡糖化學結構提供信息，故而褐藻膠裂解酶逐步成為優先降解褐藻酸鈉的方法。另外，褐藻膠裂解酶還能應用于肺囊腫性纖維化癥的治療、海藻飼料加工及海藻遺傳工程等領域的研究(Wong TY et al.AnnualReview of Microbiology,2000,54:289-340)。

褐藻酸裂解酶來源于海洋動植物和多種微生物(包括海洋細菌、土壤細菌和真菌)。褐藻酸鈉裂解酶按其底物專一性可分為兩大類：1,4-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和1,4-L-古羅糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.11)。至今，褐藻膠裂解酶的生產大多依賴原始產酶動植物或微生物來獲得酶蛋白，此種方法雖然能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產量有限，成本較高，較難滿足實際應用需求。隨著生物技術的發展，提供了利用基因工程高效生產褐藻膠裂解酶的技術方法。Dong Eun Kim等根據已知的相關功能基因的相似序列設計PCR引物，從Streptomyces sp.ALG-5菌株中克隆到了一個褐藻膠裂解酶基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表達(Kim et al.Marine Biotechnology.2009.11:10-16)。采用這一策略必須對相關基因序列有一定的了解才能設計PCR引物，并且找到的是某一類結構或功能相似蛋白質中的新分子，較難發現全新的基因。

隨著高通量測序技術的不斷發展，越來越多的產褐藻膠裂解酶的微生物基因組序列得以測定，這使得通過基因組挖掘技術來分析序列信息，對編碼褐藻膠裂解酶的基因進行釣取變得簡潔快速，Badur AH等對來源于海洋的一株細菌Vibrio splendidus的基因組進行序列測定，通過分析發現該菌株中含有4個編碼褐藻膠裂解酶的基因，對其進行了基因克隆和在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中的重組表達(Badur et al Appl.Environ.Microbiol.2015.81：1865-1873)；目前獲得褐藻膠裂解酶大多數是專一性降解均聚甘露糖醛酸的褐藻膠裂解酶，少數是具有具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻膠裂解酶，而具有廣泛底物特異性的褐藻膠裂解酶則非常稀少，只有來源于Pseudoalteromonas sp.的褐藻膠裂解酶Aly-SJ02(李建偉,Marine Drugs,2011,21:1374-80)，來源于白蟻腸道的Isoptericola halotolerans的褐藻膠裂解酶AlyIH(竇文芳等,Carbohydrate Polymers,2013,98:1476-82)等具有廣泛底物特異性的酶活力較低，而且穩定性差，其中AlyIH只是獲得了純化的酶，尚未獲得其編碼基因，不能進行重組表達和分子改造；而且大多數褐藻膠裂解酶活性較低。本發明涉及的重組褐藻膠裂解酶具有高活性和高穩定性的特點，其降解產物為低聚合度(主要是二糖、三糖和四糖)的褐藻膠寡糖，具有重大的工業化應用前景。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，提供一種新型褐藻膠裂解酶。

本發明還要解決的技術問題是，提供包含上述褐藻膠裂解酶的基因工程菌及其構建方法。

本發明最后要解決的技術問題是，提供上述褐藻膠裂解酶的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種褐藻膠裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。