[發明專利]玉米轉錄因子ZmbHLH167及其應用

有效

• 申請號: 201710467168.7
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107266541B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 宋任濤;馮帆;祁巍巍;朱晨光
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/82;C12N9/22;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 顧勇華

本發明涉及玉米轉錄因子ZmbHLH167及其應用。該基因為SEQ ID NO：1所示的堿基序列。該序列編碼的蛋白ZmbHLH167通過利用CRISPR?Cas9技術將ZmbHLH167的基因片段SEQ ID NO：2作為guide RNA進行轉化玉米幼胚，并獲得基因缺失突變體的植株。相對野生型籽粒而言，轉基因突變體玉米籽粒顯著變小但發芽率并未受到影響。生化分析表明，轉基因突變體玉米籽粒的淀粉含量明顯下降，而蛋白和總油脂含量顯著上升，為創造高品質玉米提供遺傳資源。

技術領域

本發明涉及一種玉米轉錄因子ZmbHLH167及其應用。

技術背景

玉米（Zea mays）是世界上最重要的糧食作物之一，同時也是重要的禽畜飼料以及重要的工業原料。隨著世界人口的不斷增加，提高玉米的產量和品質對于人類來說具有重要的意義。玉米胚乳是玉米籽粒主要的營養儲存場所，胚乳中含有大量的淀粉（占胚乳干重約80%）和蛋白（占胚乳干重約10%），玉米的胚中含有大量的油脂。

研究者通過對一系列玉米籽粒突變體的研究，希望能夠提高玉米的產量和品質。例如， opaque2突變體使得人類必需氨基酸賴氨酸含量增加接近2倍。研究表明，此突變體蛋白品質的改善得益于非醇溶蛋白和醇溶蛋白比例的增加。因此，玉米籽粒突變體的產生對于研究和改造玉米具有極其重要的研究意義。

CRISPR-Cas9 技術是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細胞打靶和TALEN 等技術后第四種基因敲除的新技術，此種基因敲除的方法具有效率高、速度快、生殖系轉移能力強及簡單經濟的特點，被廣泛應用于敲除各個物種并且效率很高。其作用機制是利用靶點特異性的RNA 將 Cas9 核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割導致突變。

之前的研究報道，在模式植物擬南芥中有一個名為ZHOUPI (ZOU)的bHLH轉錄因子，ZOU的突變導師擬南芥種子胚乳滯留且導致胚的發育受阻，故認為ZOU是一個調控胚乳發育的重要轉錄因子。隨后有文獻報道在玉米中利用RNA干擾技術將ZOU在玉米中的的直系同源進行基因沉默（也就是ZmbHLH167），但由于RNA干擾后的籽粒仍有45%的殘余表達，故并未觀察到明顯的突變表型。為了對ZmbHLH167進行更為透徹的研究，我們利用CRISPR-Cas9技術將ZmbHLH167進行基因敲除。敲除后發現籽粒明顯變小，但籽粒的發芽率并未發生顯著變化；生化成分分析發現，胚乳三大營養物質的含量的比例發生顯著變化，使得玉米胚乳中較為匱乏的蛋白和油脂的含量均發生顯著升高，故為高品質玉米的創造做出重要貢獻。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種轉錄因子ZmbHLH167。

本發明的目的之二在于提供該轉錄因子ZmbHLH167的構建方法。

本發明的目的之三在于提供該轉錄因子的應用。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種玉米轉錄因子ZmbHLH167，其特征在于該轉錄因子具有SEQ ID NO:1所示的堿基序列。

一種載體，其特征在于該載體含有上述的轉錄因子ZmbHLH167。

一種構建上述的玉米轉錄因子ZmbHLH167的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：采用pCAMBIA3301 為轉基因載體，將SEQ ID NO:2所示序列作為gRNA spacer和scaffold連入pCAMBIA3301轉基因載體中獲得，其中pCAMBIA3301 載體經過改造，以玉米U6啟動子和終止子表達gRNA，同時以玉米泛素啟動子和NOS終止子表達玉米密碼子優化的Cas9蛋白。

一種上述的轉錄因子ZmbHLH167在控制玉米籽粒大小的應用。