[發(fā)明專利]水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒及其制備和用于檢測(cè)分析PKA的活性和抑制性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710465656.4
• 申請(qǐng)日: 2017-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN107083241B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陽(yáng)明輝;張凱娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號(hào): C09K11/71
• 分類號(hào): C09K11/71;C01B25/32;G01N21/64
• 代理公司: 長(zhǎng)沙市融智專利事務(wù)所(普通合伙) 43114
• 代理人: 張偉;魏娟

1.一種水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于：在攪拌條件下，將含檸檬酸鈉和磷酸鹽的溶液緩慢滴加到pH為8.5~9.5、且含鈣鹽和聚乙二醇的溶液I中，混合均勻，得到前驅(qū)溶液；將所述前驅(qū)溶液調(diào)節(jié)pH值至9~10，并超聲分散后，轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜中，在170~200°C進(jìn)行水熱反應(yīng)2~3.5h，反應(yīng)液經(jīng)過冷卻，離心處理，調(diào)節(jié)pH至中性，即得；

所述溶液中檸檬酸鈉的濃度為0.05~0.3mol/L，磷酸鹽的濃度為0.03~0.2mol/L；所述溶液I中鈣鹽的濃度為0.02~0.2mol/L，聚乙二醇的質(zhì)量為鈣鹽質(zhì)量的1~10%；

所述鈣鹽和磷酸鹽的摩爾比為1.5~2:1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于：

所述的磷酸鹽為磷酸二氫銨和/或磷酸氫二鈉；

所述的鈣鹽為硝酸鈣和/或氯化鈣。

3.根據(jù)權(quán)利要求1~2任一項(xiàng)所述的水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于：

所述溶液的滴加速率為0.1~1mL/min；

所述超聲分散的時(shí)間為0.5~1.5h；

所述離心處理的離心速率為3000~5000 r/min。

4.一種水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒，其特征在于：由權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)制備方法制得。

5.基于權(quán)利要求4所述水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒檢測(cè)蛋白激酶PKA濃度的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）將含ATP、Mg(NO₃)₂和含絲氨酸多肽的混合溶液與一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PKA溶液分別反應(yīng)，得到一系列酶反應(yīng)液；

2）各酶反應(yīng)液分別與羥基磷灰石熒光納米顆粒溶液反應(yīng)，得到一系列待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3）各待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液通過熒光儀器檢測(cè)，得到一系列相應(yīng)的熒光值；

4）建立標(biāo)準(zhǔn)PKA溶液濃度與熒光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

5）未知濃度的待測(cè)PKA溶液按照1）、2）和3）步驟進(jìn)行反應(yīng)和熒光檢測(cè)，得到熒光值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)PKA溶液的濃度。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒檢測(cè)蛋白激酶PKA濃度的方法，其特征在于：

所述含ATP、Mg(NO₃)₂和含絲氨酸多肽的混合溶液中ATP的濃度為0.2~5 ，含絲氨酸多肽的濃度為0.1~2.5，Mg(NO₃)₂的濃度為0.5~1.5 mM；ATP與含絲氨酸多肽的濃度比為1~3:1；

所述一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PKA溶液濃度分別為1 U/L、2 U/L、4 U/L、6 U/L、20 U/L、40 U/L和50 U/L；

步驟1）中的反應(yīng)溫度為35~38℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5~1.5h。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒檢測(cè)蛋白激酶PKA濃度的方法，其特征在于：步驟2）中的反應(yīng)溫度為0~5℃，反應(yīng)時(shí)間為20~40min。

8.基于權(quán)利要求4所述的水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒檢測(cè)蛋白激酶PKA抑制性的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）含ATP、Mg(NO₃)₂、含絲氨酸多肽和PKA的混合溶液與一系列不同濃度的PKA抑制劑溶液分別反應(yīng)，得到一系列酶反應(yīng)液；

2）各酶反應(yīng)液分別與羥基磷灰石熒光納米顆粒溶液反應(yīng)，得到一系列待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3）各待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液通過熒光儀器檢測(cè)，得到一系列相應(yīng)的熒光值；

4）建立標(biāo)準(zhǔn)PKA抑制劑溶液濃度與熒光值的S型曲線；

5）未知濃度的待測(cè)PKA抑制劑溶液按照1）、2）和3）步驟進(jìn)行反應(yīng)和熒光檢測(cè)，得到熒光值，并依據(jù)S型曲線，得到待測(cè)PKA抑制劑溶液的濃度。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的水溶性羥基磷灰石熒光納米顆粒檢測(cè)蛋白激酶PKA抑制性的方法，其特征在于：

所述含ATP、Mg(NO₃)₂、含絲氨酸多肽和PKA的混合溶液中ATP 的濃度為0.2~5 ，含絲氨酸多肽濃度為0.1~2.5，Mg(NO₃)₂濃度為0.5~1.5 mM，PKA濃度為1~50 U/L；ATP與多肽的濃度比為1~3:1；

所述一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PKA抑制劑溶液的濃度分別為0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.32、0.5、0.75、1、2、3、3.5和4.5；

步驟1）中的反應(yīng)溫度為35~38℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5~1.5h；

步驟2）中的反應(yīng)溫度為0~5℃，反應(yīng)時(shí)間為20~40min。