[發明專利]一種微滴式數字PCR檢測低比例痕量目標基因的遺傳分析方法

在審

• 申請號: 201710463422.6
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107099609A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 劉彥慧;何怡;婁季武
• 申請（專利權）人: 東莞市婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種微滴式數字PCR檢測低比例痕量目標基因的遺傳分析方法。

背景技術

每染色體都有兩條的二倍體生物，如人、鼠、豬等，于一對染色體(同源染色體)相同位置的成對等位基因或多態性位點的兩個成員，分別來自父方和母方，若相同即為純合子，若不同則為雜合子；既決定生物體性狀，也是判斷子代與親代之間遺傳關系的依據。

具有生物學功能而控制相對性狀的等位基因，其作用有顯性和隱性之分；顯性基因(用大寫字母A表示)在雜合狀態下表現其性狀，而隱性基因(用小寫字母a表示)只有在純合狀態下才表現明顯性狀。在遺傳中，子代的等位基因是由父親方的一個基因和母親方的一個基因而組合遺傳；而在配對組合過程中，就存在雜合子和純合子兩種情況；所謂雜合子，就是從一方A基因，另一方得到a基因，配對后就是Aa組合；而純合子是從父母雙方來的基因都是一樣的，也就組合成AA或aa。對人類而言，絕大部分的遺傳病都是隱性的，如果子代的隱性遺傳病基因型為aa，則為臨床表型嚴重的患者，絕大部分為致死致殘的嚴重后果。據此隱性遺傳病的分子機制和遺傳規律，只要父方未將致病的隱性基因a遺傳給子代，子代即可排除基因型為aa的純合子重癥患者。

與個體遺傳背景相關的同源染色體上多態性位點，即人類遺傳標記，如單核甘酸多態性(SNP)、短串聯重復序列(STR)等，也同樣存在純合和雜合兩種狀態。根據遺傳規律，子代某多態位點上的兩個等位基因分別來自父母雙方，無基因突變的情況下，如果子代未遺傳疑父的其中一個基因，則可排除其親緣關系。其次，基因組上的等位基因，有與其緊密連鎖的多態性位點；通過對夫婦雙方的等位基因單倍型分析，以確定雙方與的差異性連鎖多態位點，通過檢測子代基因組或孕期母體血漿游離DNA中是否存在父方的多態位點目標序列，即可確定子代是否遺傳了父方連鎖的等位基因；如母方與等位基因A連鎖的SNP位點為T、與a連鎖的為C，父方與A連鎖的為G、與a連鎖的為A，那么只要在子代基因組或孕期母體血漿游離DNA中未檢測到此多態位點A堿基等位基因，即可確定子代沒有遺傳與此連鎖的a基因而排除aa純合的可能。

另外，目前造血干細胞移植是臨床上治療白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、重型再生障礙性貧血、地中海貧血等血液系統疾病的最有效手段之一；根據造血干細胞的來源，可以分為自體、異體同基因(如雙胞胎)、以及異基因(如父母、同胞、無血緣關系者)移植，其中絕大部分為異基因移植。異基因干細胞移植的目的是建立供者型的正常造血與免疫功能，以取代受者原有的異常的造血及免疫系統，其成敗的關鍵在于受者與供者的造血與免疫系統能否和平共處，即形成一種平衡的嵌合狀態。由此可見，為判斷移植是否成功并及時地實施免疫抑制治療、預后等，需要對移植后受體體內形成的供、受者外周血細胞嵌合體進行檢測并觀察其變化趨勢。從遺傳學的角度來說，嵌合體本質上是兩個基因型不同的混合物，嵌合狀態的檢測與變化實質上是兩個基因型的比例；因此，利用兩個不同基因型之間的差異等位基因為標志進行定量分析，即可獲得兩者的拷貝數比例而獲知其嵌合狀態。

要實現人類、鼠、猴等哺乳類動物的上述遺傳分析目標，可對已出生的受檢對象進行取樣和DNA分析，也可采用孕期穿刺手術胎兒取樣(如胎兒絨毛、羊水或臍帶血標本)DNA分析，還可以孕期母體外周血漿游離DNA為樣本進行檢測；而在具體實踐之中，由于目前普遍采用的創傷性穿刺采樣手術可導致宮內感染、流產、胎兒死亡等并發癥，且局限于采樣的合適孕周，所以均趨向于現癥個體取樣或孕期母體外周全血無創取樣的DNA檢測遺傳分析。