[發(fā)明專利]提高BRAF基因V600E突變的診斷效率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710463164.1
• 申請(qǐng)日: 2017-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN109136367B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊國華;呂娟;焦曄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 格諾思博生物科技南通有限公司;上海格諾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明涉及提高BRAF基因V600E突變的診斷效率的方法。本發(fā)明人優(yōu)化了檢測(cè)BRAF基因V600E位點(diǎn)突變的檢測(cè)試劑，在此基礎(chǔ)上提供了檢測(cè)BRAF基因V600E位點(diǎn)突變的試劑盒、用途及檢測(cè)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及提高BRAF基因V600E突變的診斷效率的方法。

背景技術(shù)

BRAF基因又稱鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1基因，是人類最重要的原癌基因之一，主要發(fā)生于黑色素瘤、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中。

BRAF基因突變絕大多數(shù)集中在第15號(hào)外顯子第1799位堿基(TA)，導(dǎo)致編碼的氨基酸變化(V600E)。該突變導(dǎo)致下游MEK-ERK信號(hào)通路持續(xù)激活，驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。BRAF基因V600E突變檢測(cè)可用于指導(dǎo)黑色素瘤患者BRAF激酶抑制劑的使用和結(jié)直腸癌EGFR抗體的靶向治療，還可作為結(jié)直腸癌和甲狀腺癌患者輔助診斷和病情預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

目前常用的BRAF V600E突變檢測(cè)方法有測(cè)序法和ARMS-PCR法。測(cè)序法靈敏度較低約20％，且操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長。ARMS-PCR法通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5’端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3’端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，需有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的3’則導(dǎo)致PCR不能延伸。ARMS-PCR方法能夠達(dá)到1％的靈敏度，對(duì)于突變比例較高的腫瘤組織樣本尚能夠滿足檢測(cè)需求，但是對(duì)于突變含量低的組織樣本，尤其是取材方便的液態(tài)活檢樣本，如血液、尿液和唾液樣本，難以有效檢測(cè)。另外，有研究表明，基因敏感突變的比例與靶向藥物療效關(guān)系密切，而測(cè)序法和ARMS-PCR方法均為定性檢測(cè)，僅能提供基因有無突變的信息，無法給出腫瘤突變的比例，不足以判斷突變?nèi)蹶栃曰颊呤欠衲苁芤嬗诎邢蛑委煛?/p>

因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)改進(jìn)的或新的BRAF V600E突變檢測(cè)方法，來改變上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的現(xiàn)狀。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供提高BRAF基因V600E突變的診斷效率的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒，所述試劑盒中包括：

(1)擴(kuò)增BRAF基因V600E突變位點(diǎn)區(qū)域的特異性前引物和后引物，所述的特異性前引物和后引物擴(kuò)增包含基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為50～150bp(較佳地為50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特異性前引物與突變型基因位點(diǎn)及鄰近序列完全互補(bǔ)；較佳地，其3’末端堿基與BRAF基因V600E突變位點(diǎn)堿基互補(bǔ)；或

擴(kuò)增BRAF基因V600E突變位點(diǎn)區(qū)域的前引物和特異性后引物，所述的前引物和特異性后引物擴(kuò)增包含基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為50～150bp(較佳地為50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特異性后引物與突變型基因位點(diǎn)及鄰近序列完全互補(bǔ)；較佳地，其3’末端堿基與BRAF基因V600E突變位點(diǎn)堿基互補(bǔ)。

(2)特異性針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針，所述的探針攜帶可檢測(cè)標(biāo)記。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記。

在另一優(yōu)選例中，所述的BRAF基因V600E突變?yōu)椋築RAF基因的第15號(hào)外顯子第1799位堿基發(fā)生TA的突變。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性前引物的長度為10-25bp；較佳地為12-20bp；或所述的特異性后引物的長度為10-25bp；較佳地為12-20bp。