[發(fā)明專利]高特異性MMP-14底物肽及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710462607.5
• 申請(qǐng)日: 2017-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN107501394B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫璐;楊志民;賀慧寧;解樹平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K5/117;C07K1/04;C07K1/06;C07K1/16;C07K1/107;C12Q1/37
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本發(fā)明屬于生物酶檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種高特異性MMP?14底物肽及其制備方法和應(yīng)用。該底物肽具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：其中，n為4?30的整數(shù)，F(xiàn)1和F2分別為熒光基團(tuán)及其對(duì)應(yīng)的淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的底物具有高特異性，該底物以多肽及PEG結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，在基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)及癌癥檢測(cè)治療應(yīng)用方面具有廣闊的前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物酶檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種高特異性MMP-14底物肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMPs)是一類自然進(jìn)化中高度保守的，活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，其廣泛分布于植物、脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物中。目前該家族已分離鑒別出28個(gè)成員，編號(hào)分別為MMP1-28。該家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成，包括疏水信號(hào)肽序列、前肽區(qū)(保持酶原的穩(wěn)定)、催化活性區(qū)(Zn²⁺結(jié)合位點(diǎn))、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)(與酶的底物特異性有關(guān))。MMPs成員在上述共同結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上各有特點(diǎn)，不同MMPs結(jié)構(gòu)中底物結(jié)合區(qū)內(nèi)側(cè)殘基側(cè)鏈大小不同直接導(dǎo)致底物結(jié)合的差異性。根據(jù)作用底物的種類以及片斷同源性，MMPs可分為6類：膠原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)；明膠酶(MMP-2、MMP-9)；間質(zhì)水解酶(MMP-3、MMP-10、MMP-11)；基質(zhì)水解酶(MMP-7、MMP-26)；膜型MMP(MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25)和其他分泌型MMP(MMP-19、MMP-21、MMP-23、MMP-27、MMP-28)。

MMPs的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)的有效成分，在細(xì)胞遷移、血管生成、胚胎發(fā)育、動(dòng)脈粥樣硬化、肝腎纖維化疾病、惡性腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等病理生理過程中發(fā)揮重要的作用。通過對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的檢測(cè)，可以深度了解其性質(zhì)及致病機(jī)理，并進(jìn)一步了解病癥的惡化程度，從而進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)治療。鑒于MMPs在生理和病理進(jìn)程中起著關(guān)鍵性的作用，對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)技術(shù)的研究開發(fā)是十分必要的。

MMP-14作為MMPs家中的重要一員膜蛋白，發(fā)揮著降解基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生命功能。研究表明，其在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和宮頸癌的轉(zhuǎn)移與侵襲中都扮演著重要的角色。研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-14參與另兩個(gè)重要的MMPs家族成員MMP-2、MMP-13酶原的激活過程，而這兩個(gè)蛋白酶也已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，換言之，MMP-14是研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制中非常關(guān)鍵的一環(huán)，對(duì)其性質(zhì)的深入研究將有望揭示致病機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的有效診斷和治療。

目前常見的MMPs酶活檢測(cè)方法有：熒光明膠酶檢測(cè)法、明膠酶譜法、DQ明膠原位酶譜分析、高效液相色譜法、肽鏈修飾的熒光探針技術(shù)以及熒光分子斷層成像技術(shù)。其中熒光探針技術(shù)相比其它技術(shù)具有可實(shí)現(xiàn)“實(shí)時(shí)、可視、定量”的高靈敏度檢測(cè)的潛力，具有一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。目前報(bào)道的肽鏈修飾的熒光探針主要可以分為3類：酶活性熒光成像探針、靶向探針和交聯(lián)成像探針。其中基于多肽的熒光探針是研究最廣的酶活性成像探針。此類成像探針的底物是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的原理設(shè)計(jì)。FRET作為一種方便、快捷、靈敏的光學(xué)手段被廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、生物結(jié)構(gòu)研究等領(lǐng)域，特別是在蛋白酶活性的測(cè)定中效果顯著。

然而由于MMPs家族蛋白酶之間具有較明顯的底物交叉活性，如何提高底物肽的特異性成為熒光類檢測(cè)探針開發(fā)中的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種提高M(jìn)MPs乃至酶底物特異性的方法。該法通過在底物中引入適當(dāng)?shù)膌inker和具有特異性結(jié)合的非底物結(jié)合肽，極大提高了酶對(duì)底物催化的特異性。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種高特異性MMP-14底物肽，該底物肽具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：