[發明專利]高特異性MMP-14底物肽及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710462607.5
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107501394B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 孫璐;楊志民;賀慧寧;解樹平
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K5/117;C07K1/04;C07K1/06;C07K1/16;C07K1/107;C12Q1/37
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本發明屬于生物酶檢測領域，具體涉及一種高特異性MMP?14底物肽及其制備方法和應用。該底物肽具有如式I所示的結構：其中，n為4?30的整數，F1和F2分別為熒光基團及其對應的淬滅基團。本發明的底物具有高特異性，該底物以多肽及PEG結構為基礎，在基質金屬蛋白酶檢測及癌癥檢測治療應用方面具有廣闊的前景。

技術領域

本發明涉及生物酶檢測領域，更具體地，涉及一種高特異性MMP-14底物肽及其制備方法和應用。

背景技術

基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMPs)是一類自然進化中高度保守的，活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，其廣泛分布于植物、脊椎動物、無脊椎動物中。目前該家族已分離鑒別出28個成員，編號分別為MMP1-28。該家族成員具有相似的結構，一般由5個功能不同的結構域組成，包括疏水信號肽序列、前肽區(保持酶原的穩定)、催化活性區(Zn²⁺結合位點)、富含脯氨酸的鉸鏈區和羧基末端區(與酶的底物特異性有關)。MMPs成員在上述共同結構的基礎上各有特點，不同MMPs結構中底物結合區內側殘基側鏈大小不同直接導致底物結合的差異性。根據作用底物的種類以及片斷同源性，MMPs可分為6類：膠原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)；明膠酶(MMP-2、MMP-9)；間質水解酶(MMP-3、MMP-10、MMP-11)；基質水解酶(MMP-7、MMP-26)；膜型MMP(MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25)和其他分泌型MMP(MMP-19、MMP-21、MMP-23、MMP-27、MMP-28)。

MMPs的主要功能是降解細胞外基質的有效成分，在細胞遷移、血管生成、胚胎發育、動脈粥樣硬化、肝腎纖維化疾病、惡性腫瘤的浸潤與轉移等病理生理過程中發揮重要的作用。通過對基質金屬蛋白酶的檢測，可以深度了解其性質及致病機理，并進一步了解病癥的惡化程度，從而進行及時檢測治療。鑒于MMPs在生理和病理進程中起著關鍵性的作用，對于基質金屬蛋白酶檢測技術的研究開發是十分必要的。

MMP-14作為MMPs家中的重要一員膜蛋白，發揮著降解基底膜與細胞外基質以及調節細胞運動、生長、分化、凋亡等多種生命功能。研究表明，其在結腸癌、胃癌、乳腺癌和宮頸癌的轉移與侵襲中都扮演著重要的角色。研究還發現，MMP-14參與另兩個重要的MMPs家族成員MMP-2、MMP-13酶原的激活過程，而這兩個蛋白酶也已被實驗證實與腫瘤的侵襲和轉移緊密相關，換言之，MMP-14是研究腫瘤侵襲和轉移機制中非常關鍵的一環，對其性質的深入研究將有望揭示致病機理，實現對疾病的有效診斷和治療。

目前常見的MMPs酶活檢測方法有：熒光明膠酶檢測法、明膠酶譜法、DQ明膠原位酶譜分析、高效液相色譜法、肽鏈修飾的熒光探針技術以及熒光分子斷層成像技術。其中熒光探針技術相比其它技術具有可實現“實時、可視、定量”的高靈敏度檢測的潛力，具有一定的技術優勢。目前報道的肽鏈修飾的熒光探針主要可以分為3類：酶活性熒光成像探針、靶向探針和交聯成像探針。其中基于多肽的熒光探針是研究最廣的酶活性成像探針。此類成像探針的底物是基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理設計。FRET作為一種方便、快捷、靈敏的光學手段被廣泛應用于化學分析、生物結構研究等領域，特別是在蛋白酶活性的測定中效果顯著。

然而由于MMPs家族蛋白酶之間具有較明顯的底物交叉活性，如何提高底物肽的特異性成為熒光類檢測探針開發中的關鍵問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高MMPs乃至酶底物特異性的方法。該法通過在底物中引入適當的linker和具有特異性結合的非底物結合肽，極大提高了酶對底物催化的特異性。

為了實現上述目的，本發明提供一種高特異性MMP-14底物肽，該底物肽具有如式I所示的結構：