[發(fā)明專利]一種測(cè)序樣本制備系統(tǒng)及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710461336.1
• 申請(qǐng)日: 2017-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107216989A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 景奉香;江平;劉亞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海小海龜科技有限公司
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00;C12Q1/68
• 代理公司: 上海晨皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31260
• 代理人: 成麗杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種測(cè)序樣本制備系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)

從1977年第一代DNA測(cè)序技術(shù)(Sanger法)，發(fā)展至今三十多年時(shí)間，測(cè)序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展。

第一代DNA測(cè)序技術(shù)用的是1975年由Sanger和Coulso開(kāi)創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)法(鏈降解)。并在1977年，桑格測(cè)定了第一個(gè)基因組序列，是噬菌體X174的，全長(zhǎng)5375個(gè)堿基。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開(kāi)端步入基因組學(xué)時(shí)代。研究人員在Sanger法的多年實(shí)踐之中不斷對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。在2001年，完成的首個(gè)人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測(cè)序基礎(chǔ)。

第一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999％，但其測(cè)序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)開(kāi)發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為代表的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了。第二代測(cè)序技術(shù)大大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，但在序列讀長(zhǎng)方面比起第一代測(cè)序技術(shù)則要短很多。

以Roche 454測(cè)序系統(tǒng)為例，它是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營(yíng)二代測(cè)序技術(shù)的平臺(tái)。它的主要測(cè)序原理是：

(1)DNA測(cè)序樣本制備

454測(cè)序系統(tǒng)的文件構(gòu)建是利用噴霧法將待測(cè)DNA打斷成300-800bp長(zhǎng)的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y(cè)DNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。

(2)Emulsion PCR(乳液PCR)

454的DNA擴(kuò)增過(guò)程是將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的微球上，并在其上面孵育、退火。

(3)焦磷酸測(cè)序

測(cè)序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果。

目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測(cè)序技術(shù)——Ion Torrent。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片。這一技術(shù)的發(fā)明人同時(shí)也是454測(cè)序技術(shù)的發(fā)明人之一，Jonathan Rothberg，它的文庫(kù)和樣本制備跟454技術(shù)很像，只是測(cè)序過(guò)程中不是通過(guò)檢測(cè)焦磷酸熒光顯色，而是通過(guò)檢測(cè)H+信號(hào)的變化來(lái)獲得序列堿基信息。Ion Torrent相比于其他測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，成本相對(duì)來(lái)說(shuō)會(huì)低，體積也會(huì)比較小，同時(shí)操作也要更為簡(jiǎn)單，速度也相當(dāng)快速，除了兩天文庫(kù)制作時(shí)間，整個(gè)上機(jī)測(cè)序可在2-3.5小時(shí)內(nèi)完成，不過(guò)整個(gè)芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測(cè)序。

與一般的測(cè)序平臺(tái)不同，半導(dǎo)體芯片測(cè)序的核心是由大規(guī)模離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFET)陣列組成的半導(dǎo)體芯片，其中包含了數(shù)百萬(wàn)個(gè)孔和離子感應(yīng)器。其核心原理是利用ISFET測(cè)量堿基在DNA鏈上延伸時(shí)釋放質(zhì)子/氫離子導(dǎo)致的PH值的變化。用ISFET測(cè)量pH值或生物分子等技術(shù)已經(jīng)是廣為人知技術(shù)，相關(guān)的研究也一直方興未艾。

半導(dǎo)體芯片上的每一個(gè)傳感單元有一個(gè)微球槽，每個(gè)微球槽原則上只能放入一個(gè)表面攜帶某一條DNA片段克隆簇的微球(可以包括各種磁性微球、乳膠微球、水凝膠微球等)。

半導(dǎo)體基因測(cè)序具體的測(cè)序原理為：

在每一個(gè)ISFET傳感單元上，通過(guò)CMOS標(biāo)準(zhǔn)工藝技術(shù)開(kāi)一個(gè)微球槽，微球槽的大小僅能容納一個(gè)微球；

在每一個(gè)微球上通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，獲得大量序列相同的DNA片段(10,000以上)，這樣可以增加每次堿基配對(duì)并酶促合成時(shí)釋放出來(lái)的氫離子總量，達(dá)到增強(qiáng)測(cè)試信號(hào)的目的。

用ISFET探測(cè)酶促合成時(shí)釋放出來(lái)的氫離子從而獲得相應(yīng)微球所裝載核酸的序列。