[發明專利]一種無血清的上皮細胞培養液

有效

• 申請號: 201710460522.3
• 申請日: 2017-06-18
• 公開（公告）號: CN107312745B
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 張曉娥;盧永波;李瀟;吳迪
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明實施例提供一種無血清的上皮細胞培養液，涉及生物醫學領域，包括基礎培養液、必需添加因子、生長因子、貼壁因子、激素、細胞增殖分化的調節因子以及細胞凋亡抑制劑。通過添加P53抑制劑、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）協同抑制細胞凋亡的作用，達到抑制細胞培養過程中出現的細胞凋亡，同時添加細胞增殖分化的調節因子，從而避免細胞過早衰老，適用于大規模的細胞擴增培養。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及一種無血清的上皮細胞培養液。

背景技術

化學物直接接觸或者暴露于眼部，會引發刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性風險評估是危害評價以及風險規避程序中非常需要的一項。傳統方法中對新型化合物的眼刺激潛在風險的評估主要依賴于體外的兔子實驗，這種方法耗時耗力、且成本較高。因此，尋找快速、經濟的化合物篩選方法成為該領域的一項迫切需求，并激發了大量的關于眼表刺激性風險評估的體外替代方法的建立，例如牛角膜不透明度及滲透性檢測，雞胚尿囊膜實驗等，上述技術通過一定程度的組合可以實現體外眼刺激性評價，但卻都無法完全實現兔眼刺激實驗的體外替代；另外，這些體外替代方法適用范圍有限，只能評價化妝品原料，不能評價化妝品成品。近年來，隨著體外器官培養技術的發展，基于體外細胞培養構建的3D重組角膜上皮模型，在眼刺激風險評價領域表現出特有的優勢，類似于人體角膜上皮的細胞三維結構，不僅可以更為真實的反映人體對化學物的響應，準確給出化學物刺激性的預測，對于化合物篩選的種類也具有更寬的應用范疇，不僅適用于化妝品原料的危害評價，還可以用于不同劑型的化妝品成品的危害評估。

目前，角膜上皮細胞是構建體外三維角膜上皮組織模型最理想的種子細胞，構建的三維角膜模型的生物學特性更能反映真實的角膜組織。然而由于分化后的角膜上皮細胞體外生長的生命周期很短，只能傳2～3代，獲得的細胞數量少，花費較高，限制了角膜組織的研究和組織工程化角膜的構建。如何改進體外培養技術，培養出分裂增殖能力強、能不斷分裂生長的角膜上皮細胞，以補充細胞的不斷更新，成為獲得角膜上皮種子細胞的首要任務。另外，研究發現口腔黏膜上皮細胞與角膜上皮細胞特征相似，亦可以用于構建角膜樣模型。

現如今，無論是角膜上皮細胞還是口腔黏膜上皮細胞的培養大多是參照皮膚KC的培養技術，早期多采用有血清培養基和組織塊法，血清成份占10-20%。Souhtgaet等綜合分析了培養基中的各種成份對原代口腔上皮細胞生長分化的影響，研究發現含血清10%的培養基成纖維細胞生長明顯，對正常的口腔上皮細胞造成嚴重的污染，影響口腔黏膜上皮細胞在醫學領域的應用。隨后許多上皮細胞的培養采用酶解培養法，即用胰酶和 DispaseⅡ酶酶解的方法分離上皮細胞，然后以3T3作為滋養層的技術來進行的，但由于滋養細胞的存在影響試驗結果的分析。而且，許多研究者相信3T3細胞和人細胞共同培養有可能引起突變或異種蛋白對人KC的轉染，強調在選擇性手術中盡量不用滋養層培養上皮細胞。為了避免使用滋養層，人們發展了多種方法：如培養皿表面涂細胞基質成份；不同濃度的鈣和各種生物提取物、促分裂物和微量元素的添加。Arehnolti Bdnslev應用含10%血清的無滋養層培養方法，上皮細胞可傳代兩次，細胞形成復層，培養基中的血清除了誘導細胞過度分化導致上皮復層化外，血清中不明蛋白的存在，對細胞的信號轉導和細胞表面標志形成干擾，另外，培養基中牛血清可能含外源性污染物和其它慢病毒，對人有潛在的危險。

針對上述問題，許多學者正尋求和使用無血清培養基，目前已有商品化的無血清培養基如K-SFM和MCDB153。MCDB153是經過多次改善得到的一款角質細胞無血清培養基，但在細胞培養過程中表現出局限性，繁殖和擴增細胞的能力有限，研究發現如果角質細胞在MCDB153中生長至完全匯合，則快速地喪失其傳代能力。另外無血清培養基缺乏通用性，一種無血清培養基只能做到為一種或少數幾種細胞株設計或優化出高密度生長或高水平目的產物表達的培養基，而其他細胞在這樣的培養基體系中并不能較好的增殖生長。