[發(fā)明專利]構(gòu)建重組皮膚模型的黑素與角質(zhì)形成細(xì)胞氣液面培養(yǎng)基

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710460501.1
• 申請(qǐng)日: 2017-06-18
• 公開（公告）號(hào): CN107326004A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李芳;盧永波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及構(gòu)建重組皮膚模型的黑素與角質(zhì)形成細(xì)胞氣液面培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

人類皮膚顏色的形成主要是黑素細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的黑素小體到達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞，并在角質(zhì)形成細(xì)胞中重新分布。建立人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型可以為研究皮膚色素發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供研究平臺(tái)。生理情況下，黑素細(xì)胞可以通過樹突與周圍角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生接觸和聯(lián)系，角質(zhì)形成細(xì)胞通過直接的細(xì)胞間連接控制黑素細(xì)胞的生長、形態(tài)、樹突形成和抗原表達(dá)。

黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)分為單層細(xì)胞共培養(yǎng)和重建三位表皮結(jié)構(gòu)的共培養(yǎng)，前者比較簡便，能為研究黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞提供較理想的體外模型，因而被大多數(shù)學(xué)者所采用，但這種模型并不能形成類似于皮膚的細(xì)胞復(fù)層化結(jié)構(gòu)，與皮膚正常生理結(jié)構(gòu)存在一定的差距。后者能夠準(zhǔn)確的模擬表皮黑素單元，為體外研究黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用，色素的轉(zhuǎn)移與分布提供了良好的模型基礎(chǔ)。

目前含黑素重組人工皮膚存在的問題是黑素生發(fā)不均勻，導(dǎo)致黑素模型表面有點(diǎn)狀黑素聚集或半月形黑素聚集，與正常人皮膚狀態(tài)不一致，形成類似于斑狀皮膚，這對(duì)于黑素模型的美白功效評(píng)價(jià)形成阻力。

CN201019018002.2含色素的人工皮膚檢測模型及其制備方法中使用的黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加了具有還原性的維生素C，對(duì)黑素的生發(fā)有抑制作用，不利于后期美白功效評(píng)價(jià)，且其培養(yǎng)的含色素人工皮膚模型存活時(shí)間較短，只有6到11天，不利于長效美白產(chǎn)品的功效評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了構(gòu)建重組皮膚模型的黑素與角質(zhì)形成細(xì)胞氣液面培養(yǎng)基，通過聚集的不正常生發(fā)的黑素模型組織切片發(fā)現(xiàn)，主要是因?yàn)楹谒厣l(fā)不均勻，局部角質(zhì)形成細(xì)胞生發(fā)過量導(dǎo)致的，本專利培養(yǎng)基具有促進(jìn)黑素細(xì)胞均勻生發(fā)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過量生發(fā)的特點(diǎn)，霍亂毒素和TPA的添加促進(jìn)黑素細(xì)胞貼壁和增殖并且抑制角質(zhì)形成細(xì)胞貼壁和增殖。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種構(gòu)建重組皮膚模型的黑素與角質(zhì)形成細(xì)胞氣液面培養(yǎng)基，構(gòu)建重組皮膚模型的黑素與角質(zhì)形成細(xì)胞氣液面培養(yǎng)基以500ml計(jì)包括：

角質(zhì)無血清培養(yǎng)基K-SFM 500ml，胰島素 2～30μg，氫化可的松 10～800μg，牛腦垂體提取物 10～200mg，上表皮生長因子 20～2000μg，堿性成纖維生長因子 1～1500μg，角質(zhì)細(xì)胞生長因子 5～80μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 20～200ng，CaCl₂ 10～200mg，霍亂毒素 20～200nM。

進(jìn)一步地，角質(zhì)無血清培養(yǎng)基K-SFM 500ml，胰島素 3～10μg，氫化可的松 100～300μg，牛腦垂體提取物 20～80mg，上表皮生長因子 200～600μg，堿性成纖維生長因子 5～17μg，角質(zhì)細(xì)胞生長因子 6～20μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 30～100ng，CaCl₂ 20～100mg，霍亂毒素 20～50nM。

進(jìn)一步地，角質(zhì)無血清培養(yǎng)基K-SFM 500ml，胰島素 5μg，氫化可的松 250μg，牛腦垂體提取物 35mg，上表皮生長因子 500μg，堿性成纖維生長因子 1.25μg，角質(zhì)細(xì)胞生長因子7μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 50ng，CaCl₂ 在氣液面培養(yǎng)的第一天添加27.5mg，氣液面培養(yǎng)的第二天添加55mg，氣液面培養(yǎng)的第三天及以后添加82.5m，霍亂毒素 25nM。

由于該培養(yǎng)基不含血清，排除血清中眾多不明細(xì)胞因子，如抗原、抗體、激素等干擾，可提高某些藥物或因子對(duì)表皮細(xì)胞影響研究的準(zhǔn)確度和精確性，為體外美白測試準(zhǔn)確性提供基礎(chǔ)。該培養(yǎng)基不含維生素C，對(duì)于后期在黑素模型上進(jìn)行美白評(píng)價(jià)提高準(zhǔn)確性具有重要意義，該培養(yǎng)基可使2種細(xì)胞均迅速增殖，黑素細(xì)胞樹突多為3～5個(gè)，黑色素細(xì)胞在皮膚基底層內(nèi)散在分布，細(xì)胞突起伸入到角質(zhì)形成細(xì)胞之間，銀染染色顯示黑色素細(xì)胞內(nèi)及重組皮膚切面有大量色素顆粒存在，黑色素細(xì)胞增殖狀態(tài)良好，該培養(yǎng)基可保持2種細(xì)胞構(gòu)建形成的重組皮膚模型較長時(shí)間的存活率，可使重組皮膚模型存活時(shí)間達(dá)到13-18天，有利于較長時(shí)間的美白功效評(píng)價(jià)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)實(shí)施例構(gòu)建的體外重組人體皮膚表皮黑色素模型，采用蘇木精-伊紅染色，透射電鏡和免疫組織化學(xué)分析法檢測體外重組人體皮膚表皮模型的結(jié)構(gòu)分層；