[發明專利]一種3D表皮模型的構建方法

有效

• 申請號: 201710460494.5
• 申請日: 2017-06-18
• 公開（公告）號: CN107287150B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 支旭勃;盧永波
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于組織工程技術領域，具體涉及一種3D表皮模型的構建方法。該方法用絲裂霉素C（Mitomycin C，MC）處理的成纖維細胞作為滋養層，在其上接種角質形成細胞，利用成纖維細胞分泌的各種因子和蛋白等供給角質形成細胞生長需要，同時配合低濃度血清及EGF、胰島素及CaCl₂，經液下及氣液面兩個階段的培養，構建形成3D表皮模型。本發明所構建的3D表皮模型與人體表皮結構高度一致，且降低了生產成本，滿足規模化生產3D表皮模型所需的經濟、有效且高效的要求。

技術領域

本發明屬于組織工程技術領域，具體涉及一種3D表皮模型的構建方法。

背景技術

傳統的化妝品原料篩選及產品開發驗證主要通過動物實驗來完成，由于種屬差異及個體差異導致動物實驗的結果無法準確評估其安全性和功效性，且結果重現性差。動物福利保護組織對于抵制動物實驗的呼聲也越來越高。鑒于上述原因，歐盟、美國及其他國家已相繼立法禁止經動物實驗的化妝品或原料在其市場銷售，為了滿足化妝品開發需求，有效評估其安全性和功效性，推動化妝品產業升級，動物替代檢測應運而生，而與人體皮膚結構高度一致的皮膚模型成為替代檢測方法中的核心工具，表皮模型作為其中一種更是有著舉足輕重的地位，因此開發一種符合檢測要求，且經濟實惠的表皮模型意義重大。

構建表皮模型所用的角質形成細胞是表皮細胞中的主要細胞，它可以形成表皮模型特有基本結構，即基底層、棘層、顆粒層和角質層。一般的角質形成細胞培養多選用無血清培養體系，通過給基礎培養液中添加各種外源性的因子，保證角質形成細胞狀態穩定、延緩老化發生。但無血清培養液中的添加因子多數都比較昂貴如牛腦垂體提取物（BovinePituitary Extract，BPE），嚴重影響角質形成細胞及拓展產品的規模化的生產，該細胞在傳統的含血清培養體系中又極易發生老化問題而導致模型構建失敗，如何解決表皮細胞在含血清培養體系中的增殖、分化問題成為技術的關鍵。

由于角質形成細胞具有干細胞特性，因此利用滋養層細胞為突破該技術難題提供了可能。滋養層細胞是干細胞篩選、培養及誘導型多功能干細胞（iPSCs）培養常用的一種技術，原代或初期培養階段一般都需依賴于能分泌他們在體外存活增殖所必需的生長因子的飼養層細胞。不同類型的飼養層細胞分泌的生長因子略有不同，但都要求培養過程中的滋養層細胞不分裂不增殖而仍保持代謝活性。常見的可作為滋養層的細胞有成纖維細胞、3T3細胞、間充質細胞等，常用的有絲分裂阻斷劑為絲裂霉素C（Mitomycin C，MC），它與DNA鏈形成交聯，抑制DNA復制，對RNA也有抑制作用，從而達到上述目的。

CN104459145A公開了一種化妝品檢測，通過給市售的聚碳酸脂膜上包被IV型膠原，然后通過無血清培養液（Epilife）構建表皮模型，首先按照發明公示內容，僅在培養液中添加脂質混合物和Ca2+即可構建成功表皮模型缺乏理論支持。其次培養液中的脂質添加物價格昂貴，且因為大部分為非水溶物質處理過程中不可避免需引入助溶試劑如二甲基亞峰（DMSO），過量引入或長期殘留在培養液中會對細胞的生長帶來不可預測的影響。

中國專利201310425798.X公開了一種組織工程表皮模型的構建方法，首先對桑蠶絲進行脫膠、溶解、透析和濃縮制備絲素蛋白溶液，然后用制備的絲素蛋白溶液浸潤熱塑性無紡布，后經過真空干燥及乙醇處理，制備成接種支撐物，然后上面接種人表皮細胞株HaCat構建成表皮模型。整個支撐物處理過程繁瑣、復雜，且引入非皮膚結構的熱塑性無紡布，不管是對構建培養中的液體營養傳遞，還是對后期檢測后的組織學切片及結果分析都會產生極大的影響。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種3D表皮模型的構建方法。該方法用絲裂霉素C處理的成纖維細胞作為滋養層，利用成纖維細胞分泌的各種因子和蛋白等供給角質形成細胞生長需要，同時配合低濃度血清及EGF、胰島素及CaCl2，可以最大限度滿足角質形成細胞的生長和分化需求，降低3D表皮模型的生產成本。