[發(fā)明專利]一種增強(qiáng)HIV?1核酸疫苗免疫原性的佐劑

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710457600.4
• 申請(qǐng)日: 2017-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107287268A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡攀勇;徐鵬;鄧付婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京佰泰克生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;A61K39/39;A61K39/21;A61P31/18
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)HIV-1核酸疫苗免疫原性的佐劑。

背景技術(shù)

DNA疫苗具有制作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，使其在細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等多種疾病的防治與治療中有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值，可能對(duì)人類疾病的防治以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展起到劃時(shí)代的作用。美國(guó)FAD已批準(zhǔn)乙肝疫苗等幾十余種DNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，顯示出DNA疫苗的巨大潛力和應(yīng)用前景。而由于DNA疫苗的免疫源性較弱的緣故，往往要與佐劑共同使用來(lái)增強(qiáng)其作用效果。

艾滋病(AIDS)是由艾滋病病毒(HIV)進(jìn)入機(jī)體后，破壞機(jī)體的免疫細(xì)胞，最終導(dǎo)致機(jī)體的免疫能力完全消失，從而引發(fā)各類疾病的一種嚴(yán)重傳染性疾病。編碼HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的基因主要有三種：Env、Pol、Gag。Pol和Gag主要編碼病毒的核內(nèi)蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白，而Env基因主要編碼其病毒膜表面的蛋白，并且中和抗體的表位基本都在Env基因上。目前尚無(wú)有效的疫苗和藥物用于預(yù)防和清除感染的HIV病毒。DNA疫苗作為新興的疫苗，有著傳統(tǒng)疫苗無(wú)法代替等諸多優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外也將DNA疫苗看作攻克艾滋病的關(guān)鍵技術(shù)之一，但目前制約DNA疫苗發(fā)展的最大問(wèn)題是免疫原性不強(qiáng)，因此找到有效的佐劑來(lái)增強(qiáng)DNA疫苗的效果迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種酶解多肽作為佐劑來(lái)增強(qiáng)HIV DNA疫苗的免疫原性，增強(qiáng)HIV DNA疫苗的體內(nèi)免疫應(yīng)答效率。

本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種酶解多肽，通過(guò)如下方法制備而成：以羊骨為酶解反應(yīng)的底物，用胰蛋白酶酶解，用超濾膜截留分子量5000-3000u的組分，冷凍干燥。

優(yōu)選地，酶解條件為pH值7.8-8.2，酶解溫度46-50℃，酶解時(shí)間3-5小時(shí)。

優(yōu)選地，所述酶解多肽通過(guò)如下方法制備而成：將新鮮羊骨用清水洗凈，經(jīng)0.08-0.12MPa高壓蒸煮0.5-1.5h使其軟化，破碎成1-3cm³的骨粒，置于蒸餾水中，加入胰蛋白酶酶解；酶解結(jié)束后，加熱使胰蛋白酶滅活，冷卻至常溫，12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-25分鐘，取上清，依次用截留分子量為10000u、5000u、3000u的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，收集截留分子量5000-3000u的組分，冷凍干燥。

優(yōu)選地，胰蛋白酶添加量為底物重量的0.3-0.5％。

優(yōu)選地，酶解條件為pH值8.0，酶解溫度48℃，酶解時(shí)間4小時(shí)。

優(yōu)選地，加熱使胰蛋白酶滅活的方法為：在80-90℃條件下水浴8-12分鐘。

優(yōu)選地，經(jīng)0.1MPa高壓蒸煮1h使其軟化。

上述酶解多肽用于HIV-1核酸疫苗佐劑的用途。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明酶解多肽可以顯著增強(qiáng)HIV核酸疫苗的免疫原性，增強(qiáng)HIV核酸疫苗的體內(nèi)免疫應(yīng)答效率(包括體液免疫和細(xì)胞免疫)，有助于提高HIV核酸疫苗的免疫效果。

附圖說(shuō)明

圖1為常規(guī)IgG ELISA分析HIV-1Env特異性體液免疫反應(yīng)強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步介紹。實(shí)施例中未特別強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。

實(shí)施例1：酶解多肽的制備

新鮮羊骨清水洗凈后-20℃冷凍保存?zhèn)溆茫怀瑸V杯和超濾膜購(gòu)于上海摩速科學(xué)器材有限公司；胰蛋白酶(＞2.5×10⁵U/g)，北京索萊寶科技有限公司。

酶解多肽通過(guò)如下方法制備而成：

將新鮮羊骨用清水洗凈，經(jīng)0.1MPa高壓蒸煮1h使其軟化，破碎成1-3cm³的骨粒，置于蒸餾水中，加入胰蛋白酶酶解(胰蛋白酶添加量為底物重量的0.4％)，酶解條件為pH值8.0，酶解溫度48℃，酶解時(shí)間4小時(shí)；酶解結(jié)束后，在85℃條件下水浴10分鐘使胰蛋白酶滅活，冷卻至常溫，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清，依次用截留分子量為10000u、5000u、3000u的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，收集截留分子量5000-3000u的組分，冷凍干燥。

實(shí)施例2：酶解多肽的免疫增強(qiáng)作用

一、實(shí)驗(yàn)材料

酶解多肽按照實(shí)施例1方法制備。

6-8周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠，用于免疫評(píng)價(jià)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、HIV-1質(zhì)粒DNA的制備