[發明專利]影響合成武夷菌素的基因簇及篩選鑒定該基因簇的方法和應用

有效

• 申請號: 201710454648.X
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107418959B
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 葛蓓孛;張克誠;趙文珺;劉炳花;施李鳴;麻金金
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/66;C12N15/76;C12Q1/689
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司 11003
• 代理人: 王長祿

本發明提供一種cluster26基因簇影響武夷菌素的合成；一種快速篩選、鑒定微生物功能基因簇的方法，包括如下步驟：第一步，選擇目的基因；第二步，利用Gibson方法構建缺失目的基因的重組基因載體：1)設計目的基因擴增兩個同源臂的引物，在引物上設有重疊區；2)對步驟1)中引物序列進行PCR擴增，獲得左、右同源臂；3)選取質粒的酶切位點切割質粒，獲得線性質粒；4)將步驟2)中的左、右同源臂組裝到線性質粒上，得到組裝產物；5)利用組裝產物大量構建重組基因載體；第三步，利用重組基因載體構建突變株，驗證目的基因是否為功能基因。本發明的有益效果是：利用該方法構建重組載體的時間縮短，加快菌株基因選育的進度。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地說涉及一種影響合成武夷菌素的基因簇及篩選鑒定該基因簇的方法和應用。

背景技術

微生物產生的具有生物活性的天然產物(次級代謝產物)，其是人類抵抗癌癥、衰老和感染性疾病、抗癌藥物、臨床及農用抗生素以及免疫抑制劑等，可廣泛應用于人、畜及農業等方面，對人類生產生活具有重要的應用價值。在已完成測序的微生物的基因組還含有大量的隱形天然產物生物成基因簇，這些信息為將來新功能天然藥物的篩選挖掘提供了寶貴的資源庫，傳統建庫篩選的方法操作步驟繁瑣，耗時耗力。

進一步，鏈霉菌是一類來源于土壤的革蘭氏陽性細菌，它可以產生豐富的次級代謝產物，包括抗癌藥物、臨床及農用抗生素以及免疫抑制劑等，可廣泛應用于人、畜及農業等方面，對人類生產生活具有重要的應用價值。自然界中，絕大多數的農用抗生素都是由鏈霉菌產生。武夷菌素產生菌不吸水鏈霉菌武夷變種作為鏈霉菌的一員，其代謝產物武夷菌素是一種高效、廣譜、低毒的生物農藥，可用于防治蔬菜、果樹、糧食和經濟作物真菌病害，對蔬菜真菌病害防治效果尤為明顯，如黃瓜白粉病、番茄葉霉病和黃瓜黑星病等，同時武夷菌素還具有一定的增產作用。自問世以來，武夷菌素以其良好的防治效果在農業上得到了廣泛的應用，直接創造經濟效益超過了10億元，并且在2008年北京奧運會期間，武夷菌素被列為政府采購的特供農藥。武夷菌素作為一種微生物次級代謝產物對作物病害防治具有十分明顯的防效，因此如何提高其在生產過程中的效價和產量，獲得高產、高效的工業菌株是目前工業化生產亟需解決的問題，也是提高武夷菌素市場競爭力的根本手段。傳統的菌株選育主要是通過NTG、60Coγ射線、原生質體融合、低能碳離子注入以及亞硝基胍等誘變方式選育，但由于在誘變過程中缺乏特異性的靶標，導致正向突變率低且工作量大。因此，隨著分子生物學及代謝工程技術的發展，近年來菌株選育工作轉向基因工程育種。

目前，在對微生物菌進行基因(簇)功能研究的過程中采用傳統的酶切連接方法構建重組載體，通過接合轉移的方法使同源臂發生同源重組雙交換得到基因(簇)缺失突變株。但是在構建重組載體的過程中，傳統的酶切連接存在很多弊端，例如：需要反復多次進行酶切連接與驗證；當組裝多個片段時需要涉及到多個不同的酶切位點；需要T 載體作為中間載體過程繁瑣；組裝片段較長時連接效率低等。因此，尋找一種簡便高效的重組載體組裝方法對于菌株的基因(簇)功能研究及基因工程定向育種具有重要意義。

發明內容

本發明克服了現有技術中的不足，提供了一種影響合成武夷菌素的基因簇；另一種，快速篩選、鑒定武夷菌素產生菌中產生武夷菌素的功能基因簇的方法，其簡便高效的重組載體組裝方法對于菌株的基因(簇)功能研究及基因工程定向育種具有重要意義；另一種，該方法在篩選微生物菌的功能基因的應用。

本發明的目的通過下述技術方案予以實現。

cluster26基因簇為影響合成武夷菌素的DNA基因簇，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2中所示的DNA基因簇；

(b)編碼與(a)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA基因簇。

進一步，cluster26基因簇來源于武夷菌素產生菌(S.ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15)的7552300-7562712位堿基序列。