[發明專利]一種淬滅酶產業化生產中酶活力的快速精確檢測方法

在審

• 申請號: 201710452980.2
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN109142551A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 李爽;王海燕;張廣民
• 申請（專利權）人: 北京挑戰生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/89;G01N30/34;G01N30/06
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 黃玉玨

本發明提供了一種新型飼用酶制劑產業化的檢測方法，即淬滅酶酶活的HPLC檢測方法。本發明提供的用于檢測淬滅酶酶活的HPLC方法，其流動相選擇乙腈和三乙胺水溶液；所述方法還包括，在HPLC檢測前，還對淬滅酶樣品進行了抽提和稀釋，所述抽提的提取液和稀釋液為含有曲拉通或牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。實驗證明，本發明提供的淬滅酶酶活的HPLC檢測方法重復性和時效性好，準確性高。

技術領域

本發明屬于酶制劑技術領域，具體涉及一種新型酶制劑產業化的檢測方法，即淬滅酶生產中酶活力的快速精確檢測方法。

背景技術

N-酰基高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是許多革蘭氏陰性菌群體感應系統中的信號分子，能夠調節許多動植物病原菌致病菌基因的表達。研究發現AHLs的降解對細菌群體的生長并沒有影響，但是能夠抑制群體間的信號傳遞，從而使依靠群體感應來調節致病基因表達的病原菌毒性降低甚至喪失。這個發現為生物農藥和疾病治療提供了新的方法和思路。N-酰基高絲氨酸內酯酶可以水解AHLs的內酯鍵，使信號分子失去活性，從而降低病原菌產生的危害。因此對N-酰基高絲氨酸內酯酶的研究成為當前農業和醫藥領域的研究熱點。

北京挑戰生物技術有限公司和中國農業科學院飼料研究所歷經5年聯合研發，獲得了國際領先高科技生物新產品-水產專用淬滅酶，其起效成分是N-酰基高絲氨酸內酯酶。作為國內唯一一家將N-酰基高絲氨酸內酯酶產業化的企業，多年來在淬滅酶的酶學特性分析、改進以及應用方面開展了大量的研究和推廣工作。研究中包含淬滅酶產業化檢測方法的建立。目前，已報道的淬滅酶檢測方法主要有液相色譜法和生物傳感器法兩種，這兩種方法都是通過測定酶的作用底物N-酰基高絲氨酸內酯(以下簡稱AHLs)的減少量來定義酶活力的大小。

生物傳感器法是目前應用最廣泛的淬滅酶定性檢測方法，其主要原理是采用AHLs結構基因缺失菌株作為指示菌株，該菌株自身不能合成AHLs。在外源AHLs的作用下，它們能夠發光、變色或者表達β-半乳糖苷酶活性，因而具有檢測AHLs的功能。然后根據指示菌發光強弱或顏色變化距離來測定反應液中AHLs的殘留量，通過計算可以得出AHLs的消耗量，進而計算出淬滅酶的酶活。利用細菌生物傳感器法是檢測AHLs的有效手段，該方法簡單、易得、不需要昂貴的設備。基于A.tumefaciens和C.violaceum的細菌生物感應器是最常用的兩種生物感應器。但是，由于該方法受操作人員和環境的影響較大，其定量的準確性和重復性較差。在實際應用過程中，該方法多用于AHLs產生菌株和淬滅酶表達菌株的篩選。此外，該生物法檢測周期在24h以上，而在生產過程中需要快速檢測酶活以便于指導發酵過程的控制以及半成品、成品的加工。因此，基于生物傳感法所存在的檢測精度低、可重復性差、時效性差的特點，該方法是滿足不了產業化檢測需求的。

液相色譜法是利用AHLs在201nm下具有強吸收，以峰面積和標準底物濃度建立標準曲線，根據反應液中底物的峰面積值計算出反應液中AHLs的殘留量，通過計算得出AHLs的消耗量和淬滅酶的酶活。與生物傳感器檢測法相比，液相色譜法受人員操作和環境的影響小，檢測時長短，適合生產過程中AHLs的定量檢測。但目前采用該方法測量的精確度和重現性較差，還不能用于淬滅酶的精確測量。

綜上，通過對已報道的酶活檢測方法進行的測試和分析，發現已有的淬滅酶檢測方法存在測量精度低、重現性差、測量周期長等缺點，難以滿足淬滅酶產業化過程中的檢測需求。

發明內容