[發(fā)明專利]海藻酸鈉接枝衍生環(huán)糊精固定化細胞及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710452656.0
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107022542B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 申雁冰;王敏;于子棋;商志華;夏夢雷
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04;C12P33/02
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，具體如下：在甾體生物催化反應中，以衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠作催化劑，反應結束后，進行過濾，濾液用于收集反應產物，過濾物即衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，重新投入甾體生物催化反應，進行循環(huán)利用；

所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠的制備方法如下：

(1)海藻酸鈉接枝衍生環(huán)糊精

按海藻酸鈉和衍生環(huán)糊精按摩爾比1:0.2-1:1.5稱取海藻酸鈉和衍生環(huán)糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸鈉45-55倍的蒸餾水，30-70℃水浴中攪拌使之完全溶解；

按環(huán)氧氯丙烷與蒸餾水體積比0.05-1:50加入環(huán)氧氯丙烷，同時按環(huán)氧氯丙烷與NaOH溶液體積比0.05-1:10滴加0.5mol/L的NaOH溶液，滴加時間10min，之后反應1.5-6.5h；

(2)固定化細胞膠珠的制備

待步驟(1)的反應液冷卻后，加入終濃度為1-30g/L的菌體靜息細胞，攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/L的CaCl₂溶液中，將膠珠在CaCl₂溶液中繼續(xù)浸泡1-6h，過濾，用反應溶液洗滌1-8次，即得衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠；

所述反應溶液為Tris-HCl緩沖溶液、生理鹽水或純水，pH7.0-pH7.6。

2.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠循環(huán)利用的次數為8次以上。

3.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，所述的衍生環(huán)糊精為羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、磺酸基-β-環(huán)糊精、羥丙基-γ-環(huán)糊精或甲基-γ-環(huán)糊精。

4.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠通過活化延長循環(huán)利用的次數，所述的活化方法具體如下：

(1)將催化效率降低的衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠10g，投入到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基進行活化，160r/min，32℃的搖床下振蕩培養(yǎng)20h；

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)菌體時使用的培養(yǎng)基；

(2)培養(yǎng)結束后將發(fā)酵液過濾得到膠珠，用反應溶液將膠珠洗滌干凈后，將其置于CaCl₂溶液中再次固定2h，反應溶液洗滌收集膠珠1-8次，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.如權利要求4所述的一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，活化后衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可再次循環(huán)利用3-5次。

6.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，過濾后的細胞膠珠使用反應溶液洗滌1-8次后，重新用于甾體生物催化反應，所述反應溶液為Tris-HCl緩沖溶液、生理鹽水或純水，pH7.0-pH7.6。

7.如權利要求6所述的一種甾體生物催化反應中衍生環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，其特征在于，所述洗滌細胞膠珠的反應溶液的用量為每克細胞膠珠10-100mL。