[發(fā)明專利]一種雙泵補料法及基于雙泵補料法的重組大腸桿菌發(fā)酵方法

有效

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• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107227287B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發(fā)明（設計）人: 史磊;申洋;郭強;張勇;鄭長春
• 申請（專利權）人: 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術領域，特別涉及一種雙泵補料法及基于雙泵補料法的重組大腸桿菌發(fā)酵方法。所述雙泵補料法為采用恒速補料泵和溶氧關聯(lián)泵對發(fā)酵液進行補料的方法，首先打開恒速補料泵，將恒速補料泵流加葡萄糖的速度調整至小于發(fā)酵液中葡萄糖的消耗速度，再打開溶氧關聯(lián)泵，設置關聯(lián)溶氧值；當發(fā)酵液的溶氧值高于所述溶氧關聯(lián)泵的設定值時，溶氧關聯(lián)泵開啟進行補料，當發(fā)酵液的溶氧值低于所述溶氧關聯(lián)泵設定值時，溶氧關聯(lián)泵關閉。采用本發(fā)明的雙泵補料法對重組大腸桿菌進行發(fā)酵，溶氧波動范圍縮小至10％。發(fā)酵結束時，發(fā)酵液的OD值達到160，發(fā)酵液中重組大腸桿菌表達的水解酶酶活達到180U/ml，大大提高了大腸桿菌的發(fā)酵水平。

技術領域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術領域，特別涉及一種雙泵補料法及基于雙泵補料法的重組大腸桿菌發(fā)酵方法。

背景技術

利用基因重組技術構建的生物工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝。就其選用的生物材料而言，前者含有帶外源基因的重組載體，而后者是單一的微生物細胞；從發(fā)酵工藝考慮，生物工程菌發(fā)酵生產的目的是希望能獲得大量的外源基因產物，盡可能減少宿主細胞本身蛋白的污染。而外源基因的高水平表達，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關，因此僅按傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產生物制品是遠遠不夠的，需要對影響外源基因表達的因素進行分析，探索出一套適于外源基因高效表達的發(fā)酵工藝。

基因工程菌發(fā)酵問題中最重要的兩個問題是菌體的高密度發(fā)酵和誘導條件的確定。菌株的高密度生長將導致供氧不足和培養(yǎng)基中大量乙酸的產生，這將極大的影響菌體的生長；另外，菌體密度的高低與外源蛋白表達量之間并沒有直接相關性，它們之間的結合點就是誘導條件的確定。

重組大腸桿菌在發(fā)酵過程中存在葡萄糖流加速率與溶氧控制相關聯(lián)的問題。如果葡萄糖流加過快，則會導致溶氧水平過低，使發(fā)酵處于厭氧狀態(tài)，目標產物產量降低；如果葡萄糖流加過慢，則會導致溶氧水平過高，菌體處于饑餓狀態(tài)，自溶現(xiàn)象增加，影響目標產物的產生。目前大腸桿菌發(fā)酵的補料方法為單泵補料法，即將溶氧與補料相關聯(lián)，如果溶氧高于設定值，補料自動開啟；溶氧低于設定值，補料自動關閉。該方法在運行過程中存在溶氧波動范圍大，上限與下限相差60％的問題，嚴重影響發(fā)酵水平的提高。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種雙泵補料法，及利用雙泵補料法對重組大腸桿菌進行發(fā)酵方法，解決了大腸桿菌發(fā)酵過程中溶氧波動范圍大，發(fā)酵水平低的技術問題。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案如下：

本發(fā)明提供了一種雙泵補料法，所述雙泵補料法為采用恒速補料泵和溶氧關聯(lián)泵對發(fā)酵液進行補料的方法，首先打開恒速補料泵，將恒速補料泵流加葡萄糖的速度調整至小于發(fā)酵液中葡萄糖的消耗速度，再打開溶氧關聯(lián)泵，設置關聯(lián)溶氧值；當發(fā)酵液的溶氧值高于所述溶氧關聯(lián)泵的設定值時，溶氧關聯(lián)泵開啟進行補料，當發(fā)酵液的溶氧值低于所述溶氧關聯(lián)泵設定值時，溶氧關聯(lián)泵關閉。

其中，所述雙泵補料法用于重組大腸桿菌發(fā)酵液加入誘導劑之后的發(fā)酵過程中。

本發(fā)明還提供了一種基于所述雙泵補料法的重組大腸桿菌發(fā)酵方法，包括以下步驟：

(1)將重組大腸桿菌種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵；

(2)發(fā)酵過程中控制發(fā)酵液的溶氧、pH及補料，使發(fā)酵液的OD值增長；

(3)當發(fā)酵液的OD₆₀₀值增長至38～42時，加入誘導劑進行低溫誘導，采用上述雙泵補料法繼續(xù)進行發(fā)酵，當發(fā)酵液的OD₆₀₀停止增長時，結束發(fā)酵。

其中，所述步驟(2)的具體步驟為：通過調節(jié)發(fā)酵罐的攪拌轉速和空氣流量將發(fā)酵液的溶氧控制在50％以上；當發(fā)酵液的pH開始下降時，用氨水調節(jié)發(fā)酵液的pH在6.5～7.5；當發(fā)酵液的溶氧上升時，將補料與溶氧關聯(lián)，設定溶氧關聯(lián)值為20％，補加葡萄糖進行發(fā)酵。