[發明專利]一種蛹蟲草線粒體基因型的檢測方法

在審

• 申請號: 201710451715.2
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107227353A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 張永杰;趙宇翔;張姝
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司)14105
• 代理人: 張福增

技術領域

本發明涉及線粒體基因型檢測領域，具體涉及一種蛹蟲草線粒體基因型的檢測方法。

背景技術

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又叫北蟲草或北冬蟲夏草，是隸屬子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、蟲草科、蟲草屬的一種絲狀真菌。現代研究證實，蛹蟲草有抗腫瘤、抑制流感病毒、對輻射損傷的保護及抗炎等多種藥理作用，目前已經在東亞地區被廣泛作為滋補品及藥用菌使用，并被用作冬蟲夏草的替代品進行開發利用。2009年蛹蟲草已被衛生部列為新資源食品(現名新食品原料)，因此蛹蟲草可作為普通食品流通。目前，蛹蟲草子實體已經實現了產業化生產，以蛹蟲草為主要成分的保健食品已有近50種，藥品有兩種。蛹蟲草在我國已經形成了一個巨大的產業，據估計年產值達100億元人民幣。盡管如此，市場上有些保健食品和藥品只標稱蟲草，而未明確說明是哪種蟲草；有的雖標稱冬蟲夏草，但實際可能為蛹蟲草。

由于具有重要的經濟價值，近年來人們陸續開展了蛹蟲草多種組學水平的研究工作。目前，蛹蟲草的核基因組和線粒體基因組均已公布，人們還開展了轉錄組、甲基化組和蛋白質組的研究。我們通過分析和比較不同蛹蟲草菌株的線粒體基因組，發現不同的蛹蟲草菌株表現出線粒體內含子的插入缺失多樣性，從而具有不同的線粒體基因型(Scientific Reports 2017,7:40219)。同時，由于為異宗配合真菌，蛹蟲草是研究真菌線粒體遺傳機制的理想材料。然而，開展線粒體遺傳機制的研究需要同時對大量蛹蟲草菌株的線粒體基因型進行分析，常規的通過測序來確定線粒體基因型的方法由于成本較高、時間較長，無法滿足該類研究的需要，亟需建立一種簡單易行的快速檢測線粒體基因型的技術體系。

根據目前已知的研究結果，蛹蟲草在其線粒體基因組中至多有8個內含子插入位點(Scientific Reports 2017,7:40219)。本發明以這8個潛在內含子位點為靶標，建立基于PCR擴增和電泳分析的快速檢測蛹蟲草線粒體基因型的技術體系。該技術體系既可輔助用于蛹蟲草遺傳穩定性和遺傳機制的研究，還可用于蛹蟲草的真偽鑒別和工業生產蛹蟲草菌株間的快速“親子鑒定”。

發明內容

本發明的目的是建立一種蛹蟲草線粒體基因型的快速檢測方法。

為達到上述目的，本發明提供的技術方案是：

一種蛹蟲草線粒體基因型的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)利用已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株，設計擴增8個線粒體內含子位點的引物，通過PCR擴增分別得到在這些內含子插入位點有對應內含子的I類擴增產物和在這些潛在內含子位點缺失內含子的II類擴增產物；

(2)純化各擴增產物并測定濃度后，將屬于同類的擴增產物按相同質量混合在一起，分別進行瓊脂糖凝膠電泳，制作成DNA分子量標準I和DNA分子量標準II；所述制作DNA分子量標準I的電泳條件：0.7％的瓊脂糖凝膠，電壓90V，時間120min；所述制作DNA分子量標準II的電泳條件：2.0％的瓊脂糖凝膠，電壓100V，時間60min；

(3)取待檢測的蛹蟲草菌株，利用與步驟(1)相同的引物進行PCR擴增，擴增產物分別按步驟(2)中DNA分子量標準I和DNA分子量標準II的瓊脂糖凝膠電泳條件進行電泳，通過與DNA分子量標準I和DNA分子量標準II的比較，獲知待檢測的蛹蟲草菌株的線粒體基因型。

所述的PCR擴增使用的引物分別為：CM-rnl-i1F1/CM-rnl-i1R1、CM-rnl-i2F1/CM-rnl-i2R1、CM-rnl-i3F1/CM-rnl-i3R1、CM-rnl-i4F1b/CM-rnl-i4R1b、CM-cob-F1/CM-cob-R1、CM-cox1-F1/CM-cox1-R1、CM-cox2-F1/CM-cox2-R1、CM-cox3-F1/CM-cox3-R1。

所述的已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株至少為V40-5和CM09-31-28或CM06。

所述的PCR擴增使用的DNA聚合酶為EasyTaq PCR SuperMix、KOD Plus Neo或KOD FXNeo。

上述技術方案中：

所有目前已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株見表1。

表1已經線粒體基因型的蛹蟲草菌株

注：√代表某菌株在對應位點有內含子，×代表在對應位點缺失內含子。該表信息來源于Scientific Reports 2017,7:40219。