[發明專利]一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法

有效

• 申請號: 201710448876.6
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107227305B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 孫英;刁劍雄;蒲承君;劉航
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N11/00
• 分類號: C12N11/00;C12N11/08;C12N11/14;C12N9/18
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發明公開了屬于酶固定化領域的一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法。本發明復合固定化方法包括步驟：(1)使用分子模擬軟件或模塊將小分子分別與乙酰膽堿酯酶分子上的區域I、區域II進行分子對接打分；(2)通過計算獲得小分子總打分；(3)將優先類小分子或良好類小分子與固定化載體表面連接，之后與乙酰膽堿酯酶孵育，得到復合固定化乙酰膽堿酯酶。本發明突破性地基于酶蛋白分子的三維結構信息，通過分析乙酰膽堿酯酶分子上不同區域的結構與性質差異，在分子層面設計固定化載體和固定方式，使酶的構象達到最適，最大限度保留了酶的活性，極大提高了固定化酶的穩定性，增大了酶的固載量，并可多次重復使用，其使用范圍更廣。

技術領域

本發明屬于酶固定化領域，具體涉及一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法。

背景技術

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，簡稱為AChE，EC 3.1.1.7)是膽堿酯酶的一大類，廣泛存在于人、動物、昆蟲等體內，可專一性將乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，是一種十分重要的與神經傳導相關的酶。乙酰膽堿酯酶可被有機磷、氨基甲酸酯類農藥特異性抑制，據此乙酰膽堿酯酶被廣泛用于農藥檢測、環境檢測等多個領域。

酶的固定化技術(Enzyme immobilization)是指將酶束縛或限制于一定區域內，但仍保留其催化特性并可回收和重復使用的一類技術。與游離酶相比，固定化酶具有高穩定性、易分離、可重復使用等特點，被廣泛應用于工業、農業、醫藥和食品等領域。

目前，乙酰膽堿酯酶(AChE)固定化方法多使用一般酶的常規固定方法，如吸附法和交聯法等。在乙酰膽堿酯酶(AChE)固定化過程中研究多集中于尋找溫和、親和性好的固定化材料和固定方法，而未考慮乙酰膽堿酯酶(AChE)蛋白分子的結構特點與區域性差異，導致乙酰膽堿酯酶(AChE)在固定化的過程中部分酶的結構發生改變，活性大幅下降。這嚴重影響了固定化酶的使用，成為固定化乙酰膽堿酯酶(AChE)實際應用的瓶頸。

乙酰膽堿酯酶的結構基礎為蛋白質，其氨基酸序列和分子三維晶體結構信息已被完全解析。同時，針對乙酰膽堿酯酶的區域性結構功能關系的研究已較為完備。研究顯示，乙酰膽堿酯酶分子上不同區域具有不同的理化性質(如，疏水性、帶電性等)，存在顯著的區域性功能差異。

為了改善現有技術中固定化乙酰膽堿酯酶(AChE)的性能，開發一種分子水平設計的專門針對乙酰膽堿酯酶區域差異的酶固定化方法具有重要意義。

發明內容

本發明為了解決現有技術中乙酰膽堿酯酶固定化過程中結構發生改變而導致活性降低的問題，基于分子對接篩選技術，提出一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法。具體技術方案如下：

一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法，包括如下步驟：

(1)區域打分：構建乙酰膽堿酯酶的三維結構數據，使用分子對接軟件或模塊將小分子分別與乙酰膽堿酯酶分子上的區域I、區域II進行分子對接打分，獲得小分子的區域I打分和區域II打分；

(2)評估分類：計算步驟(1)中所述小分子總打分，并據此將小分子分類，分為優先類小分子、良好類小分子和淘汰類小分子；

(3)酶固定化：將步驟(2)中所述優先類小分子或良好類小分子與固定化載體表面連接，之后與乙酰膽堿酯酶孵育，即得到復合固定化乙酰膽堿酯酶。

進一步地，所述乙酰膽堿酯酶為人類乙酰膽堿酯酶，或與其氨基酸序列具有85％以上相似性的具有相似功能的人類乙酰膽堿酯酶。

進一步地，所述人類乙酰膽堿酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

步驟(1)中所述乙酰膽堿酯酶的三維結構數據來自公開數據，或通過INSIGHTii、Modeller軟件進行構建。