[發明專利]一種基于微流控芯片的三維類腦發育模型的構建方法

有效

• 申請號: 201710448568.3
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN109082406B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 秦建華;王亞清;王麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12M3/00
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種基于微流控芯片的三維類腦發育模型的構建方法，其特征在于：該模型的構建方法的主要步驟為：

微流控芯片的制備；

擬胚體EBs的形成；

類腦在微流控芯片中的分化和發育；

所述微流控芯片包括：細胞外基質混懸液入口（1）、三維通道（2）、二維灌流通道（3）、二維培養基通道（4）和培養液入口（5），所述二維灌流通道（3）、二維培養基通道（4）和三維通道（2）交界處有小柱形狀的連通處，可用于營養物質傳輸；

步驟（1）微流控芯片的制備方法為：所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上下層材料均為透明透氣的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，然后上下兩層聚合物材料經過氧氣等離子體處理60-90秒進行不可逆封接；封接之后，經過高溫高壓滅菌處理備用；

步驟（2）擬胚體EBs的形成，具體步驟為：

（1）選擇帶有坑狀結構的PDMS芯片：將坑狀結構的PDMS芯片置于24孔板內，小坑結構直徑為600-800 μm，深度為100-300 μm，用于EBs的形成；

（2）使用帶有坑狀結構的PDMS芯片制備EBs：第1天，制備EBs，將2×10⁵~6×10⁵個干細胞消化成單細胞，并轉移至PDMS芯片中，離心500-800 rpm，3-5 min，所用培養基為KSR培養基，并加入5 μM Y27632和4 ng/ml bFGF；

（3）第2天，將形成的EBs轉移至低粘附的培養板中，懸浮培養，所用培養基為KSR培養基；

（4）第5天，誘導EBs向神經上皮方向分化，將KSR培養基替換為神經誘導培養基NIM；

步驟（3）類腦在微流控芯片中的分化和發育，具體步驟為：

（1）擬胚體EBs在誘導培養基NIM中培養到第11天時，將EBs轉移到微流控芯片上，使用濃度為2-10 mg/ml的Matrigel重懸EBs，并用100 μl的去尖槍頭將EBs注入微流控芯片的三維通道內，整個過程避免產生氣泡，確保冰上操作維持低溫，保證Matrigel不凝固；

（2）將含有EBs的微流控芯片置于37℃培養箱30-40 min，使Matrigel凝固；

（3）將含有EBs的微流控芯片二維培養基通道內補加培養基，靜止培養6-8 h，所用培養基為神經分化培養基NDM；

（4）灌流操作：含有細胞團的微流控芯片靜止培養6-8 h后，在二維灌流通道中插入一定長度的PTFE管，連接注射器和注射泵，設置流速20-40 μl/h，將芯片放入培養箱中進行灌流培養，繼續培養15-30天后，并實時追蹤，鑒定發現微流控芯片上的EBs可以進行持續的生長和分化，經鑒定可以形成含有不連續的特定腦區及類似大腦皮層結構的類腦，可模擬早期的腦發育過程;

所述KSR培養基的基礎成分為DMEM/F12，另外需添加占總體積20％ 的KnockOutReplacement，占總體積1％NEAA，占總體積1％GlutaMax，占總體積1％penicillin-streptomycin，以及0.1 mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF；

所述NIM培養基的基礎成分為DMEM/F12，另外需添加占總體積1％N2；占總體積1％GlutaMAX，占總體積1％NEAA，1 μg/ml heparin，占總體積1％penicillin-streptomycin；

所述NDM培養基，所用培養基為神經分化培養起，其基礎成分為體積比為1:1的DMEM/F12和Neuralbasal medium，另外需添加占總體積1％ B27，占總體積0.5％N2，占總體積0.5％ NEAA，占總體積1％GlutaMAX，占總體積1％penicillin-streptomycin，0.05 mMbeta-mercaptoethanol。

2.按照權利要求1所述的一種基于微流控芯片的三維類腦發育模型的構建方法，其特征在于：所述微流控芯片結構的寬度不等，二維灌流通道（3）和二維培養基通道（4）的寬度均為0.5 mm-1 mm，三維通道（2）的寬度為1.5 mm-2.5 mm;微流控芯片的所有通道的高度均為600-800μm。