[發明專利]梨PbrmiR397a及其應用

有效

• 申請號: 201710448270.2
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107236740B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 吳俊;薛程;張紹鈴;秦夢帆;谷超;齊開杰;王德孚;謝智華
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了梨PbrmiR397a及其應用。一種分離自‘碭山酥梨’具有調控梨果實石細胞發育的microRNA基因(PbrmiR397a)，其前體核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。通過農桿菌介導遺傳轉化方法將PbrmiR397a轉化煙草，獲得的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PbrmiR397a基因具有減少木質素合成的功能。PbrmiR397a基因的發現，為減少木質素合成的分子育種提供新的基因資源。由于PbrmiR397a基因具有同時靶向調控多個基因的優點，為分子育種提供更高效地途徑。

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，涉及梨PbrmiR397a及其應用，具體涉及從‘碭山酥梨’中分離、克隆得到一個調控梨果實石細胞發育的microRNA基因(PbrmiR397a)及其應用。

背景技術

中國每年的梨產量占到了全球產量的60％以上。但由于果實品質較差，梨的出口量只占全世界梨出口量的15％左右，而且出口價格明顯低于平均出口價格。梨石細胞含量是影響梨果實品質的重要因素之一。梨果實石細胞是由薄壁細胞在其細胞壁上沉積了大量木質素而形成的厚壁細胞。因此木質素的合成是影響石細胞發育的關鍵因素[1]。

木質素的含量與組成在不同植物、組織、細胞和亞細胞位置差異很大，且受發育階段和環境的影響[2]。雙子葉植物中主要是G-木質素和S-木質素，并有微量的H-木質素；單子葉植物中G-木質素和S-木質素含量差不多，并含有比雙子葉植物多的H-木質素。通常G-木質素和 S-木質素的含量要比H-木質素多。木質素不易進行化學降解，其含量直接影響作物轉化為生物燃料和纖維質產物的能力[3]。

木質素的研究已在多種植物中廣泛開展，包括模式植物擬南芥、林木植物(楊樹、桉樹)、作物(玉米、苜蓿、水稻、柳枝稷、甘蔗)以及少量的果蔬(竹筍、枇杷)等，但不同植物的木質素相關研究目的不盡相同。擬南芥作為模式植物，主要用于開展一些基礎研究；桉樹等林木植物作為造紙原料，柳枝稷、甘蔗等作為生物能源植物，木質素含量是制約其產物轉化的重要因素，因此，研究目標在于獲得積累較少木質素的植株或是形成更容易被化學方法降解的木質素[4]。

MicroRNAs(MiRNAs)是近年來備受關注的一類非編碼RNA，它在生物中廣泛存在，長度為19-25nt。在植物中，由具有莖環結構的miRNA前體經過DCL1(Dicer-like1)酶的兩步切割產生成熟miRNA。成熟miRNA與Argonaute蛋白結合進入RNA誘導沉默復合體 (RNA-induced silencing complex,RISC)，通過堿基互補配對的方式與靶基因的mRNA結合導致靶基因的表達被抑制，其作用機制主要包括引起靶基因mRNA降解和抑制翻譯兩種情況。miRNA在生物體的不同發育階段和不同部位，存在著時間上和空間上的特異表達，對生物體的轉錄后基因調控起著關鍵作用[5]。隨著園藝植物miRNAs研究的不斷深入，越來越多的證據表明miRNA在園藝植物生長發育，以及響應生物脅迫與非生物脅迫方面都起著重要的調節作用。

有關miRNAs調控木質素的研究最早出現在Acacia mangium上。通過對Acaciamangium 高木質素含量(41％)和低木質素含量(21％)次生木質部的兩個樣品進行高通量測序，得到了兩個miRNAs數據庫。經過比較發現這些miRNAs預測的靶基因為一些轉錄因子，而這些轉錄因子在木質素的合成過程中，起著重要的作用[6]。隨后又發現在Acaciamangium中，有 6個高度保守的miRNAs家族參與次生細胞壁的合成。其中miR 166家族在韌皮部和木質部中表達量上存在著巨大的差異。MiR 166家族的miRNAs預測的靶基因(HD-ZIPIII、C4H、CAD、 CCoAOMT)在木質素的合成過程中，擔任著重要的角色[7]。在木本植物的模式植物毛果楊 (Populus trichocarpa)中，miR 397的靶向基因為49個漆酶基因。MiR 397過量表達的轉基因毛果楊中，漆酶基因的表達量全部下調，而且與野生型相比莖干中木質素含量下降40％[8]。