[發明專利]一種疊氮吲哚二甲川菁染料分子及應用

有效

• 申請號: 201710447796.9
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107383927B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 肖性龍;曹怡芳;周冬根;李亞茹;余以剛
• 申請（專利權）人: 華南理工大學;寧波國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C09B23/10
• 分類號: C09B23/10;C09K11/06;C12Q1/04;C12Q1/44;G01N1/30
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發明公開了一種疊氮吲哚二甲川菁染料分子及應用，本發明的疊氮吲哚二甲川菁染料以吲哚二甲川菁染料為核心骨架，在吲哚的氮原子上引入了含有酯鍵和疊氮基團的側鏈。本發明所述的疊氮吲哚二甲川菁染料具有細胞膜通透性，可用于蛋白質檢測，活細胞染色，以及基于細菌內酯酶活性判斷細菌的生存狀態,選擇性抑制死細菌在反應中的擴增,從而達到對活細菌快速定量檢測的目的。本發明染料分子在活菌檢測方面更具應用前景。

技術領域

本發明涉及生物領域，涉及一種適用于細胞染色、活菌檢測的分子的結構及其在細菌檢測技術中的應用。

背景技術

WHO報告表明，全球每年發生40～60億例食源性疾病，其中約70％是因生物源性污染食品所致。目前世界公認的能引起食源性疾病的重要致病菌，如廣泛存在于奶制品、蔬菜、水產品、肉制品等中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌0157、志賀氏菌等，是影響食品安全的重要因素。微生物以多種生理狀態存在：可培養的活菌，處于非可培養狀態的活菌(Viable but Non-culturable，VBNC)，具有完整結構但無生物活性的死菌(“Ghosts”)以及膜損傷死菌。只有“活菌”才保留有原菌的毒力和致病性，對食品安全造成潛在的威脅，而經過高溫、紫外線等各種途徑滅活處理的細菌已喪失了其致病性，因此食源性致病菌檢驗的關鍵是食品中“活”的致病菌是否存在和準確定量。

目前用于區別活菌和死菌的標準主要有是否可培養，是否有代謝活性以及細胞膜是否完整。分離培養法對于活的非可培養狀態的細菌會出現漏檢。活菌EMA/PMA-PCR檢測技術是近年來迅速興起的一種高特異性，高靈敏度的核酸檢測方法。檢測依據是EMA和PMA都沒有細胞膜通透性，EMA和PMA只能滲入膜損傷的細胞,與DNA發生共價結合，從而抑制膜損傷細胞中DNA在反應中的擴增。有研究顯示，對于一些可逆性的部分膜損傷細胞(如存在于環境樣本中的細菌)，染料仍有可能穿透細胞膜，造成不同程度的活菌DNA損失，產生假陰性結果。另外，對于紫外線滅菌法、冷凍滅菌法等不直接作用于細胞膜的滅菌方法，也不能采用基于EMA或PMA的活菌PCR方法來評估滅菌方法的效果，否則會造成活細胞數目的高估。所以，細胞膜損傷可能是細菌死亡的一種極端表現形式，以細胞膜的完整性作為區分活菌和死菌的檢測標準仍有缺陷，因此需要提出一種更科學的區分標準。

發明內容

本發明目的是提供一種基于細菌酯酶活性檢測活菌數量的疊氮吲哚二甲川菁染料分子(簡稱IDA)及應用。所述的疊氮吲哚二甲川菁染料分子具有細胞膜通透性，不僅可以進入死細胞內，還可以進入活細胞內，該染料分子進入細胞后，在活細胞中細菌酯酶可以水解染料分子上的酯鍵從而使疊氮基團脫落，在死細胞中酯酶無活性導致疊氮基團無法脫落而與DNA分子發生交聯從而抑制死細胞中DNA的擴增，達到檢測活菌的目的。

本發明目的通過以下技術方案實現：

一種疊氮吲哚二甲川菁染料分子，該分子結構包括：結合基團、酶標基團、交聯基團以及連接部位四部分。分子結構如下：

上述疊氮吲哚二甲川菁染料分子用于細胞的快速熒光染色以及活菌含量檢測。

本發明疊氮吲哚二甲川菁染料分子合成方法簡單，原料廉價易得，合成路線如下：

化合物3由化合物1與溴乙酸叔丁酯反應得到；先用四氫呋喃溶解化合物1，然后在0℃下加入NaH后攪拌30min再逐滴加入溴乙酸叔丁酯，用乙酸乙酯萃取后，經過干燥、過濾、蒸發后即可得到化合物3。

化合物6由化合物3與化合物5反應得到；化合物5由乙醇溶解化合物4后加入CH₃I在85℃下攪拌過夜后濃縮、純化后得到。用乙醇溶解化合物3和化合物5加入一滴哌啶，反應物過夜回流后得到化合物6。

化合物7由化合物6加入濃鹽酸過夜攪拌回流，LCMS顯示反應完全后，經過過濾、洗滌、干燥后得到。