[發(fā)明專利]雷公藤甲素人工抗原及制備方法和多克隆抗體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710447761.5
• 申請(qǐng)日: 2017-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN107098961A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王林玲;劉佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/765
• 分類號(hào): C07K14/765;C07K14/77;C07K1/107;C07K16/16
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司51214
• 代理人: 房云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其是雷公藤甲素人工抗原及制備方法和多克隆抗體。

背景技術(shù)

蜂蜜具有抗菌、抗氧化、提高人體免疫力等多種生理功能，是食療并舉的農(nóng)產(chǎn)品，深受人們的喜愛。蜂蜜質(zhì)量和安全一直都受到社會(huì)各界的高度關(guān)注。

我國的蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》(GB14963-2011)中明確規(guī)定蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應(yīng)安全無毒，不得來源于雷公藤、博落回、狼毒有毒蜜源植物。雷公藤分布在我國長江以南及西南地區(qū)。蜜蜂在蜜源較少的情況下，會(huì)將雷公藤植物作為其蜜源，導(dǎo)致劇毒的雷公藤活性成分進(jìn)入蜂蜜中。如人們誤食此類有毒蜂蜜，會(huì)引起中毒甚至死亡。關(guān)于蜂蜜中雷公藤活性成分的檢測(cè)方法報(bào)道較少，迫切需要開發(fā)新型、快速、靈敏的雷公藤活性成分檢測(cè)體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對(duì)上述存在的問題，提供一種雷公藤甲素人工抗原及制備方法和多克隆抗體，其中雷公藤甲素人工抗原和多克隆抗體了構(gòu)成酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系，對(duì)雷公藤甲素進(jìn)行檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏的特點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種雷公藤甲素人工抗原，其由雷公藤甲素、對(duì)氨基苯甲酸以及載體蛋白偶聯(lián)而成。

由于雷公藤甲素屬于小分子化合物，不能直接作為抗原免疫動(dòng)物得到抗體，而與載體蛋白結(jié)合后，形成蛋白大分子，因而具有抗原的功能。對(duì)氨基苯甲酸其連接橋的作用，保證雷公藤甲素與載體蛋白的穩(wěn)定連接。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。

當(dāng)載體蛋白為牛血清白蛋白時(shí)，復(fù)合物為免疫抗原，用該抗原能制備雷公藤甲素多克隆抗體。當(dāng)載體蛋白為卵清蛋白時(shí)，由于其比牛血清白蛋白具有更好的免疫原性，可用于篩選單克隆抗體細(xì)胞株。

一種的雷公藤甲素人工抗原的制備方法，其包括：

將對(duì)氨基苯甲酸重氮化；

將重氮化的對(duì)氨基苯甲酸與雷公藤甲素偶聯(lián)，形成復(fù)合物；

將所述復(fù)合物與載體蛋白偶聯(lián)，即得雷公藤甲素人工抗原。

由于雷公藤堿屬于小分子化合物，不能直接作為抗原免疫動(dòng)物得到抗體，首先將對(duì)氨基苯甲酸重氮化后與雷公藤甲素偶聯(lián)，偶聯(lián)后引入羧基（—COOH），然后采用混合酸酐法將雷公藤甲素—對(duì)氨基苯甲酸與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，從而形成穩(wěn)定的雷公藤甲素—對(duì)氨基苯甲酸-載體蛋白復(fù)合物，即抗原。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，將雷公藤甲素—對(duì)氨基苯甲酸重氮化包括：將對(duì)氨基苯甲酸溶于酸鹽中，得到對(duì)氨基苯甲酸溶液，冰浴攪拌下加入NaNO2，低溫避光攪拌，加入苯胺至溶液變?yōu)樯铧S色。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，所述鹽酸的濃度為0.8-1.5mol/L，所述對(duì)氨基苯甲酸與所述NaNO2的質(zhì)量之比為5-7：1。

由于采取了上述技術(shù)方案，對(duì)氨基苯甲酸被重氮化，為其物雷公藤甲素的偶聯(lián)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，將重氮化的對(duì)氨基苯甲酸與雷公藤甲素偶聯(lián)包括：將雷公藤甲素全完溶于水中得到雷公藤甲素溶液，所述雷公藤甲素溶液與重氮化的對(duì)氨基苯甲酸混合，調(diào)節(jié)pH8-9，攪拌1-3h，離心取上清，分別加入催化量的三丁胺和氯甲酸異丁酯，低溫?cái)嚢?0-30min。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，所述雷公藤甲素與所述對(duì)氨基苯甲酸的質(zhì)量之比為3-5:4-6。

由于采取了上述技術(shù)方案，重氮化的對(duì)氨基苯甲酸與雷公藤甲素穩(wěn)定偶聯(lián)，并在復(fù)合物中引入羧基，為復(fù)合物與載體蛋白的偶聯(lián)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，將所述復(fù)合物與載體蛋白偶聯(lián)包括：將牛血清白蛋白溶于PBS，得到牛血清白蛋白溶液，往所述牛血清白蛋白溶液中加入二甲基甲酰胺。

本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，所述牛血清白蛋白與所述雷公藤甲素的質(zhì)量之比為15-20:1。

由于采取了上述技術(shù)方案，復(fù)合物與牛血清白蛋白偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的雷公藤甲素—對(duì)氨基苯甲酸-牛血清白蛋白免疫抗原。

一種雷公藤甲素多克隆抗體，其由上述的雷公藤甲素人工抗原免疫動(dòng)物，并獲取動(dòng)物的血清而得。

需要說明的是，所述動(dòng)物可以是小鼠，羊，兔，但絕不僅限與上述動(dòng)物。

綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

將小分子化合物雷公藤甲素與載體蛋白偶聯(lián)，使其成為抗原，具有免疫原性，并用該抗原免疫動(dòng)物得到雷公藤甲素多克隆抗體，抗原抗體結(jié)合構(gòu)成酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)雷公藤甲素的快速檢測(cè)，具有方便、靈敏度高的特點(diǎn)。

附圖說明

本發(fā)明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中：

圖1是各物質(zhì)的紫外分光光度計(jì)檢測(cè)鑒定圖。