[發明專利]一種細胞培養方法

有效

• 申請號: 201710447706.6
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107083361B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 林潔璇;王旭;林詞雄;李陶;朱剛
• 申請（專利權）人: 沃昕生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 深圳市深佳知識產權代理事務所(普通合伙) 44285
• 代理人: 王仲凱

本發明屬于細胞培養領域，尤其涉及一種細胞培養方法。本發明提供了一種細胞培養方法，包括如下步驟：1)分離外周血單個核細胞；2)將步驟1)的分離外周血單個核細胞添加到含有血漿和活化培養基中活化NK細胞；3)將增殖培養基添加到步驟2)中培養至第10天的外周血單個核細胞中促進NK細胞的增殖。本發明提供的細胞培養方法能有效解決體外擴增NK細胞時存在的擴增細胞量少的技術缺陷。

技術領域

本發明屬于細胞培養領域，尤其涉及一種細胞培養方法。

背景技術

細胞免疫治療是一種新興的腫瘤治療模式，是依靠自身免疫抗癌的新型治療方法。它從病人體內采集免疫細胞，然后進行體外培養和擴增，再回輸到病人體內，來激發以及增強機體的自身免疫功能，從而達到治療腫瘤的目的。與手術、放療及化療對免疫損傷不同，細胞治療能大大提高患者的抗癌免疫力，清除手術治療不能觸及的血液、淋巴或轉移到其它組織中的癌細胞、甚至是休眠的癌細胞，相比之下治療更加徹底。

NK細胞即自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗風濕、抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。其它幾個具有抗癌功能的細胞包括殺傷性T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)。由于巨噬細胞內含有很多炎癥因子，目前還無法用于細胞治療。DC是一類免疫調節細胞，主要作用是抗原加工并呈遞給T細胞，再靠T細胞發揮抗癌作用。T細胞的抗癌作用需要再次激發才有效，只有經DC活化后才能起作用T細胞初次遇到抗原時并無殺傷作用，而只是形成免疫記憶，只有再次遇到抗原后，才能激發出強有力的殺傷功能。現在很多人用的CIK中主要是經細胞因子活化的T細胞。其實，未經DC抗原呈遞、單獨靠細胞因子活化的殺傷T細胞的療效是非常有限的。與CIK和DC相比，NK除了釋放細胞因子殺傷腫瘤細胞外，還可以通過抗體介導的細胞毒效應(ADCC)和釋放穿孔素來殺傷細胞，具有更強的腫瘤殺傷能力。然而，與CIK相比，目前用NK細胞治療的相對較少，其主要原因是NK細胞的制備較難。

目前，制備人NK細胞的方法主要有兩種。一是采用磁珠分離法，直接從PBMC中分離NK細胞。但由于NK細胞在PBMC中的比例很少，所得NK細胞的數目不多，只適用于小規模制備NK細胞及分析性研究。二是體外擴增法，用PBMC或者已經分離的NK細胞，通過一些特殊細胞因子的刺激，使NK細胞在體外擴增。但是，至今大多體外擴增技術只能使NK細胞擴增幾十倍，且純度低、活性差、成本高，難以滿足臨床使用需求。

因此，研發一種能促進NK細胞大量增殖的培養方法是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

發明內容

有鑒于此，本發明公開的一種細胞培養方法能有效解決體外擴增NK細胞時存在的擴增細胞量少的技術缺陷。

本發明公開了一種細胞培養方法。包括如下步驟：

1)分離外周血單個核細胞；

2)將步驟1)的分離外周血單個核細胞添加到含有血漿的活化培養基中培養至第10天，含有血漿的活化培養基激活外周血單個核細胞活化；所述活化培養基包括：抗CD16單克隆抗體、IL-2、抗壞血酸、TGF-β1、胸腺肽和無血清基礎培養基；

3)將增殖培養基添加到步驟2)中培養至第10天的外周血單個核細胞和含有血漿的活化培養基中繼續對所述外周血單個核細胞培養直至回收細胞，所述增殖培養基包括：IL-1α、IL-2、抗壞血酸、IL-21、IL-7、4-1BBL和無血清基礎培養基。

其中，所述活化培養基對外周血單個核細胞的NK細胞進行活化。

其中，所述增殖培養基促進外周血單個核細胞的NK細胞快速增殖。