[發明專利]鴨腺病毒A型和2型雙重EvaGreen實時熒光定量PCR檢測引物

有效

• 申請號: 201710444133.1
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107012261B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 萬春和;黃瑜;程龍飛;陳翠騰;傅光華;施少華;陳紅梅;傅秋玲;劉榮昌
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供鴨腺病毒A型和鴨腺病毒2型雙重EvaGreen實時熒光定量PCR檢測引物及試劑盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1?4所示，具有很高的特異性和靈敏度。當前國內外尚未見可基于飽和熒光染料Eva Green可同時對鴨腺病毒A型和鴨腺病毒2型雙重實時熒光定量PCR檢測方法的引物研究報道，本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

技術領域

本發明提供鴨腺病毒A型和2型雙重EvaGreen實時熒光定量PCR檢測引物，屬于動物傳染病學領域。

背景技術

腺病毒基因組全長約為33 kd，基因組為線性雙鏈DNA；該類病毒顆粒為無囊膜的核衣殼呈二十面體對稱，其中腺病毒的核衣殼有3個主要結構蛋白，分別為六鄰體蛋白（Hexon）、纖維蛋白 (Fiber)和五鄰體蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各屬病毒最主要的結構蛋白，含有病毒主要的保護性抗原基因簇，與病毒的致病性密切相關。

當前，腺病毒科下設5個屬，分別為富AT腺病毒屬、禽腺病毒屬、魚腺病毒屬、哺乳動物腺病毒屬和唾液酸酶病毒屬。其中富AT腺病毒屬有5個種，分別為牛腺病毒D型、綿羊腺病毒D型、袋鼠腺病毒A型、蛇腺病毒A型和鴨腺病毒A型（簡稱DAdV-A）。

鴨腺病毒2型（duck adenovirus 2，DAd V-2）是近年來利用病毒宏基因組學發現的一種鴨源新型腺病毒，該病主要發生在20～30日齡鴨中，以肝和脾腫大、出血為主要特征，死亡率約為7％。核苷酸同源性分析比較發現，鴨腺病毒2型（GR株）和鴨腺病毒A型分離株的核苷酸同源性約為50.0%。通過對其基于Hexon蛋白的遺傳進化分析發現，所有鴨腺病毒A型分離株在遺傳進化上均處于相同的亞分支，且和綿羊腺病毒D型（OAV287株）均處于富AT腺病毒屬遺傳進化分支。但鴨腺病毒2型（GR株）和禽腺病毒A型Phelps株（雞源）與P29株（鵝源）處于同一遺傳進化分支，均屬于禽腺病毒屬遺傳進化分支。

實時熒光定量PCR方法（Real time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系。雙重實時熒光定量PCR是一種特殊的熒光定量PCR形式，其突出的特點是一次實時熒光定量PCR反應可同時檢測兩種病原，對病原復雜或存在多種基因型的病原鑒別檢測十分有效。當前，實時熒光定量的在非特異性熒光標記中，熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，分別為：不飽和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和飽和染料（主要是EvaGreen）有兩種常用的熒光染料。前期研究發現，EvaGreen對實時熒光定量PCR的抑制性遠小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲線分析（HRM），該分析正被越來越多的用于實時熒光定量PCR后的基因分型和異源雙鏈分析。此外，EvaGree穩定性極強且因其對細胞膜透性較低，而較SYBR GreenⅠ更加安全。

當前，在鴨群中存在2種腺病毒科但分屬于不同腺病毒屬的病原：鴨腺病毒A型（屬于腺病毒科富AT腺病毒屬）和鴨腺病毒2型（屬于屬于腺病毒科禽腺病毒屬）。因此，建立能夠同時對鴨群中鴨腺病毒A型和鴨腺病毒2型的檢測方法，既可簡化操作程序、節約成本，又對鴨群中2種腺病毒科但分屬于不同腺病毒屬的病原（鴨腺病毒A型和鴨腺病毒2型）的流行病學調查及開展相關病原學致病機理研究均具有重要的意義。但是，當前國內外尚未見基于飽和熒光染料Eva Green可同時對鴨腺病毒A型和鴨腺病毒2型雙重實時熒光定量PCR檢測方法的引物研究報道，本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

發明內容

本發明提供鴨腺病毒A型和2型雙重EvaGreen實時熒光定量PCR檢測引物及試劑盒, 建立能夠同時對鴨群中鴨腺病毒A型和鴨腺病毒2型檢測的EvaGreen實時熒光定量PCR方法，簡化操作程序、節約成本。