[發明專利]一種檢測山羊支原體山羊肺炎亞種的iiPCR試劑盒

在審

• 申請號: 201710443863.X
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107099608A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 儲岳峰;趙萍;朱建勛;陳勝利;郝華芳;劉永生;季文恒;翟肖輝
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所;金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司;北京華安瑞基生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域：

本發明涉及一種檢測山羊支原體山羊肺炎亞種的iiPCR試劑盒，屬于分子生物學檢測領域。

背景技術：

山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp)是山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)的病原體，同時也是絲狀支原體簇(Mycoplasma mycoides cluster,Mm cluster)的主要成員之一。其它絲狀支原體簇成員包括絲狀支原體絲狀亞種小菌落型(Mycoplasma mycodies subsp.Mycodies Small Colony,MmmSC)、絲狀支原體絲狀亞種大菌落型(Mycoplasma mycodies subsp.Mycodies Large Colony,MmmLC)、絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasma mycodies subsp capri,Mmc)、山羊支原體山羊亞種(Mycoplasma capricolum subsp.capricolum,Mcc)和牛群支原體7型(Mycoplasma bovine group 7,MBG7)等。由于這些支原體之間具有非常相似或相近的生化和血清學特性，使得由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)引起的山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP)的診斷較為困難，容易將CCPP與由其它支原體引起的疾病混淆，或者將由Mmc、MmmLC等支原體引起的山羊呼吸道疾病錯誤地歸類于CCPP。

目前，對山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測方法主要是分離培養、血清學檢測、常規PCR檢測以及利用傳統平板培養相結合的方法進行檢測。山羊支原體山羊肺炎亞種對營養要求苛刻、生長緩慢而且難以分離培養，判斷結果時只靠肉眼觀察，沒有足夠的可靠依據，影響實驗的準確性；血清學檢測既費時又費力，而且靈敏度不高；常規PCR檢測雖然避免了上述兩類方法的缺陷，但存在引物特異性不高、容易污染和臨床樣品中PCR抑制物存在造成的假陰性等問題，限制了在快速檢測診斷上的推廣應用。iiPCR(恒溫隔絕式PCR)方法憑借特異性引物和探針，有效地增加了檢測的特異性和敏感性，同時大大提高了檢測速度和檢測結果的準確率，且該方法實現反應體系的全封閉自動操作，避免了DNA的污染，具有廣泛的現場實用性，可確保快速、準確地檢測病原體，在病原體的快速定性檢測方面具有廣闊的應用前景和發展趨勢。

發明內容：

針對上述問題，本發明解決的技術問題是克服現有技術不能適應疫病現場快速、敏感和特異檢測的需求，目的在于提供一種快速、敏感、特異檢測山羊支原體山羊肺炎亞種的iiPCR試劑盒及該試劑盒的使用方法。

本發明的檢測山羊支原體山羊肺炎亞種的iiPCR試劑盒包括：Premix Ex Taq引物Mccp-specific-Forward和Mccp-specific-Revers，探針Mccp-specific-Probe，陰性對照和陽性對照，其中所述Premix ExTa引物為：

Mccp-specific-Forward：5′-GTAGCAGCTATATTCTTAATCA-3′

Mccp-specific-Reverse：5′-GCTACAAATAATTCTTGCATAC-3′

所述探針為：

Mccp-specific-Probe：5′-F-AAGTAATACCAGCAGCAACAGCAAG-Q-3′其中，F為熒光報告基團，Q為熒光淬滅基團；

優選地，所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為TAMRA。

所述陰性對照為Nuclease-free water；

所述陽性對照為含有arcD基因序列的陽性標準質粒pMD18-T/arcD。

所述引物的擴增產物為185bp片段：

GTAGCAGCTATATTCTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGTTAACTCTTTAGGAGAAGAAAAATTTATTAAAGAATTTATGGCTGGTGCTTGCGATCTTTTAGGAGTATGTTTAGTTGAATATTAAAAGTAACGCGTATGCAAGAATTATTTGTAGC

其中，帶有下劃線的序列為上下游引物，帶有著重號的序列為探針的反向互補序列。