[發明專利]一種微量抽測植物懸浮培養細胞液濃度的方法

有效

• 申請號: 201710443811.2
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107099578B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 吳小芹;潘珺;葉建仁
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;G06T7/00;G06T7/62
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種微量抽測植物懸浮培養細胞液濃度的方法，包括：1）微量抽測獲得細胞液中染色細胞的面積數據，2）染色細胞面積與細胞液濃度的標準曲線，3）建立抗性赤松13?1懸浮繼代培養的生長模型。本發明的微量抽測植物懸浮培養細胞液濃度的方法，采用微量抽測的方式測量細胞液濃度，每次僅需吸取0.1mL的待測細胞液，控制無菌的條件下該細胞液仍可繼續培養增殖；本方法使用Image?Pro Plus軟件進行計數，可批量處理數據節約時間和減少人工判斷誤差。

技術領域

本發明屬于植物細胞組培技術領域，具體涉及一種微量抽測植物懸浮培養細胞液濃度的方法。

背景技術

植物細胞懸浮培養過程中，細胞均勻分散在液體培養基中，營養利用率高、增殖速度快，并且懸浮培養的方式能夠利用大型生物反應器進行植物細胞及其代謝物的大規模工廠化生產。

植物細胞懸浮培養的收獲目標是植物細胞或其代謝物，然而植物細胞僅能在一定的濃度范圍內保持較快的生長，所以對細胞液的濃度進行實時監測具有重要意義。植物細胞多為胚性胚柄細胞團結構，且透明、較大、易沉淀，難以使用濁度法進行濃度測量。

目前，懸浮初代培養過程中，研究者多使用細胞沉降體積(SCV)測量細胞生物量，進行定量研究，經過多次培養后，植物細胞分散在細胞液中，細胞液濃度變稀、不易沉降；所以面對懸浮細胞繼代培養的低濃度、高分散的特點，定量測定細胞生物量更加難以進行。同時懸浮初代實驗中發現過濾稱重、測量細胞SCV每次需要的細胞量多，測后就不能再繼續培養；測較長時間細胞的生長曲線時，再加上實驗重復的設計，需要做的實驗非常多。顯然，SCV法測量細胞液的濃度還不能完全滿足需求。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種微量抽測植物懸浮培養細胞液濃度的方法，需要的細胞液少，可批量數據處理，節約時間和減少人工判斷誤差。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種微量抽測植物懸浮培養細胞液濃度的方法，步驟如下：

1)配制懸浮繼代細胞的系列標準濃度細胞液；染色，拍攝獲得圖片；

2)使用Image-Pro Plus軟件處理拍攝的圖片，獲得細胞液中染色細胞的面積數據；

3)將獲得的染色細胞面積數據與其標準濃度一一對應，繪制散點圖、標準曲線并得到回歸方程，并對標準曲線進行相關性評價；

4)建立植物懸浮培養細胞繼代培養的生長模型；

5)應用生長模型計算獲得懸浮培養細胞液濃度。

步驟1)中，配制懸浮繼代細胞的系列標準濃度細胞液；染色，拍攝獲得圖片；具體過程如下：

(1)收集13-1懸浮繼代的細胞，測量細胞鮮重并配制3g/30mL原始濃度細胞液，搖晃均勻，取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL原始濃度液體，分別加無菌水至10mL，制成0g/mL、0.02g/mL、0.04g/mL、0.06g/mL、0.08g/mL、0.1g/mL的標準濃度細胞液；

(2)在超凈工作臺中對各濃度的細胞液各取0.1mL加到5mL的離心管中；使用0.2mL1％醋酸洋紅染色1-2個小時，加水洗去染色液，將洗凈后的細胞液倒入35mm直徑的培養皿中；在白色底板上放置一透明潔凈的60mm玻璃平皿蓋，將35mm培養皿中的細胞液置于平皿蓋上，每個標準濃度抽測6個樣，使用相機對每個樣拍攝清晰的細胞染色照片。

步驟2)中，使用Image-Pro Plus軟件處理拍攝的圖片，獲得細胞液中染色細胞的面積數據；具體過程如下：