[發明專利]一株高產琥珀酸的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201710443617.4
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107227286B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 章文明;張婷;姜岷;信豐學;董維亮;張敏;馬江鋒
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一株高產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，它是在宿主菌中導入甲醇脫氫酶基因mdh2、3-己糖-6-磷酸合酶基因hps和3-己糖-6-磷酸異構酶基因phi；

所述甲醇脫氫酶基因mdh2來源于甲醇芽孢桿菌Bacillus methanolicus，其基因序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的宿主菌為大腸桿菌CCTCC NO:M2012351；

所述3-己糖-6-磷酸合酶基因hps和3-己糖-6-磷酸異構酶基因phi的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

2.權利要求1所述高產琥珀酸的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1) 將SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所示的序列克隆至表達載體中，得到重組質粒；

(2) 將步驟(1)得到的重組質粒轉化至宿主細胞中，得到高產琥珀酸的基因工程菌。

3.權利要求1所述高產琥珀酸的基因工程菌在發酵產琥珀酸中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，包括以下步驟：

(1a) 種子培養：將高產琥珀酸的基因工程菌接種到種子培養基中，培養10~12 h，獲得種子培養液；

(2a) 發酵產琥珀酸：將種子培養液接種到發酵培養基中，培養至OD550=0.8~1.2，添加終濃度為0.1 mM 的誘導劑IPTG和終濃度為200 mM的甲醇，再厭氧發酵，培養時間為48 h。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述種子培養基為NBS培養基，其配方如下：甜菜堿0.12 g/L，三水磷酸氫二鉀6.54 g/L，磷酸二氫鉀3.5 g/L，磷酸氫二銨3.5 g/L，七水硫酸鎂0.25 g/L，二水氯化鈣15. 0 mg/L，維生素B1 0. 5 mg/L，六水氯化鐵 1.6 mg/L，六水氯化鈷0.2 mg/L，二水氯化銅0.1 mg/L，四水氯化鋅 0.2 mg/L，二水鉬酸鈉0. 2mg/L，硼酸 0. 05 mg/L，葡萄糖 30 g/L，溶劑為水。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述發酵培養基的配方如下：磷酸二氫銨0.87 g/L，磷酸氫二銨2.6 g/L，氯化鉀0. 15 g/L，七水硫酸鎂 0.37 g/L，六水氯化鐵2.4mg/L，六水氯化鈷0.3 mg/L，二水氯化銅0. 15 mg/L，四水氯化鋅0.5 mg/L，二水鉬酸鈉0.5mg/L，硼酸0. 075 mg/L，四水氯化錳0.5 mg/L，葡萄糖 30 g/L，溶劑為水。