[發明專利]一種精確定量慢病毒包裝輔助質粒的方法

在審

• 申請號: 201710443072.7
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107435081A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 韋玉軍;李航;凌發忠;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術領域

本發明涉及慢病毒包裝技術領域，尤其涉及的是一種精確定量慢病毒包裝輔助質粒的方法。

背景技術

慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷1型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體，具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細胞、長期穩定表達外源基因等優點，因此成為導入外源基因的有力工具。

慢病毒包裝系統一般都是三質粒或四質粒包裝系統。由于四質粒系統比三質粒系統在生物安全性上更好一些，所以應用較多。其中，四質粒表達系統除了轉運質粒以外，其他三個包裝輔助質粒各自攜帶一些特殊基因，分別為gag基因、rev基因和vsv-g基因。為了提高慢病毒的感染效率和可靠性，通常需要優化三個包裝輔助質粒的比例。傳統方法是通過檢測抽提的質粒濃度，并且以質粒的分子量計算摩爾數。該方法雖然簡單易行，但無法對包裝質粒做到精確定量，在病毒包裝優化試驗中，可重復性較差。所以，建立一種簡便、準確檢測包裝輔助質粒的方法，是非常有必要的。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的精確性和重復性差的缺陷，提供了一種精確定量慢病毒包裝輔助質粒的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種精確定量慢病毒包裝輔助質粒的方法，其特征在于：包括對三個輔助質粒分別攜帶的特殊基因設計特異性引物和慢病毒包裝輔助質粒的檢測，所述的特殊基因為gag基因、rev基因和vsv-g基因，分別對gag基因、rev基因和vsv-g基因設計一對特異性引物，如下表：

優選的，所述慢病毒包裝輔助質粒的檢測的步驟如下：

S1用PCR擴增出各基因的相應片段；

S2將各基因產物分別構建在T載體上，形成新的克隆質粒；

S3分別將克隆質粒轉化到大腸桿菌中，鑒定，培養，抽提質粒；

S4根據三個質粒的核酸濃度和重組質粒的分子量，計算出相應的拷貝數，并且以此為標準品；

S5將標準品稀釋成一系列濃度梯度，由此可得到一個標準曲線；

S6上機檢測待測質粒的具體拷貝數；

S7根據三個包裝輔助質粒的具體拷貝數，優化各質粒的比例。

優選的，所述步驟S1)PCR反應體系為：以三個輔助質粒為模板，分別加入到新的PCR管中；在PCR管中，加入相應的上下游引物各2μl；然后依次加入dNTP 4μl，10×PCR Buffer 5μl，用無菌水加至50μl；最后加入高保真DNA聚合酶0.25μl。

作為優選，所述步驟S1)PCR反應條件為：預變性95℃/2min；變性95℃/20sec，退火60℃/20sec，延伸72℃/20sec，30個循環；補全延伸72℃/10min。

優選的，所述步驟S2)T載體的連接體系及條件：將PCR產物加入微量離心管中；再加入18-T Vector 1μl，補去離子水至5μl,混勻；加入5μl(等量)的SolutionⅠ,16℃反應30min。

優選的，所述步驟S3)T載體的轉化：全量(10μl)加入至100μl JM109感受態細胞中，冰上放置30min；42℃加熱45sec,再在冰中放置1min；加入890μlSOC培養基，37℃震蕩培養60min；在含有X-gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落；

重組T載體的鑒定：挑選白色菌落，使用PCR法確定載體中插入片段的長度大小；

重組質粒的抽提：將陽性克隆送交DNA序列分析，選取和保留序列正確的克隆，常規制備DNA質粒。

作為優選，步驟S5)所述的一系列濃度梯度可為10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²。

本發明提供了一種精確定量慢病毒包裝輔助質粒的方法，包括對三個輔助質粒分別攜帶的特殊基因設計特異性引物和慢病毒包裝輔助質粒的檢測，所述的特殊基因為gag基因、rev基因和vsv-g基因，分別對gag基因、rev基因和vsv-g基因設計一對特異性引物。傳統方法是通過檢測抽提的質粒濃度，并且以質粒的分子量計算摩爾數。該方法雖然簡單易行，但無法對包裝質粒做到精確定量，在病毒包裝優化試驗中，可重復性較差。與現有技術相比：本發明是以三個輔助質粒分別攜帶的特殊基因設計特異性引物，運用熒光定量PCR對包裝輔助質粒進行精確定量。通過實驗可以獲知三個包裝輔助質粒的具體拷貝數，為后續優化質粒的比例提供了數據支持，提高了實驗準確性和重復性。