[發(fā)明專(zhuān)利]基于GC-MS聯(lián)用技術(shù)的辛芍組方抗腦缺血再灌注損傷的代謝組學(xué)研究方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710441662.6
• 申請(qǐng)日: 2017-06-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107389842B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鞏仔鵬;王愛(ài)民;張楠;侯佳;李月婷;李勇軍;王永林;蘭燕宇;黃勇;鄭林;劉亭;陸苑;孫佳;陳思穎;李梅;吳林霖
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 貴州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/86
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/86;G01N30/02
• 代理公司: 11411 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 鄭自群

1.一種基于GC-MS聯(lián)用技術(shù)的辛芍組方抗腦缺血再灌注損傷的代謝組學(xué)研究方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分析大鼠血清樣品及尿液樣品：

隨機(jī)將大鼠分為模型組、假手術(shù)組和辛芍組，放入代謝籠中進(jìn)行觀察，期間正常飲食及飲水；各組大鼠按一定劑量，連續(xù)給藥10天，收集不同時(shí)間點(diǎn)的各組大鼠的血清樣品和血尿液樣品，進(jìn)行初步處理和保存；然后再次對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理、尿液樣品進(jìn)行前處理；對(duì)大鼠血清和尿液樣品進(jìn)行方法學(xué)考察，包括日內(nèi)精密度考察、日間精密度考察、重復(fù)性考察、凍融穩(wěn)定性考察和QC樣本考察，建立GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分析大鼠血清樣品及尿液樣品的指紋圖譜分析方法；

所述的血清樣品進(jìn)行前處理的具體方法為：取解凍后血清樣本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，渦混3min，冰浴10min，在4℃，10000rpm條件下，離心10min；取血清甲醇萃取液250μL，置GC進(jìn)樣瓶，N₂吹干；加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混勻，在70℃，肟化1h，加50μL衍生化試劑，混勻，在70℃，衍生化1h，冷卻后，轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中，在4℃，15000rpm條件下，離心10min，移取上清液至內(nèi)插管中，供GC-MS分析；

所述的尿液樣品進(jìn)行前處理的具體方法為：取凍存后尿樣在室溫下解凍，取尿樣上清液50μL，加60U的脲酶，渦混30s，在37℃恒溫孵育箱中孵化15min，加入180μL的甲醇，混勻，在13000rpm，4℃條件下，離心10min；取200μL上清液至GC進(jìn)樣瓶中，N₂吹干；脫水后的樣品加入50μL15mg/mL甲氧胺吡啶溶液，渦混30s，培養(yǎng)振蕩器中在30℃，200rpm條件下肟化90min；加入有1％的TMCS的MSTFA50μL，渦混30s，在70℃保持60min，放冷，加入120μL正庚烷，渦混30s，轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管中，混勻，在12000rpm，4℃條件下離心10min，取上清液至內(nèi)插管中，待GC-MS分析；

(2)利用PCA和PLS-DA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合SPSS17.0，并利用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物鑒定找出最終的差異代謝物：

在獲得GC-MS數(shù)據(jù)后，用Agilent MSD Chemstation分析軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為NetCDF格式，導(dǎo)入基于R編程軟件的XCMS的軟件進(jìn)行色譜峰提取、去噪、峰匹配、保留時(shí)間的矯正、數(shù)據(jù)導(dǎo)出、保存，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積歸一化處理，采用修正80％規(guī)則去除數(shù)據(jù)缺失值，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用SIMCA-P13.0軟件對(duì)導(dǎo)入的血清樣品數(shù)據(jù)、尿液樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，假手術(shù)組與模型組采用PCA與PLS-DA方法建模，利用變量重要性投影分析VIP值，結(jié)合SPSS17.0進(jìn)行T檢驗(yàn)，按照VIP值>1且T檢驗(yàn)時(shí)P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異代謝物；

將GC-MS檢測(cè)總離子流圖導(dǎo)入NISTAMDIS軟件中，進(jìn)行解卷積分析，利用NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GC-MS檢測(cè)的內(nèi)源性差異代謝物進(jìn)行定性分析，選擇質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配度大于700的物質(zhì)，進(jìn)行分析鑒定，進(jìn)行去硅烷化反應(yīng)，得到最終的差異代謝物；

(3)通過(guò)MetPA在線(xiàn)分析軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路分析：

為了探索腦缺血再灌注損傷引起的代謝通路的變化，以及給予辛芍組方后對(duì)這些代謝通路的影響，將血清樣本及尿樣樣品篩選出的差異代謝物導(dǎo)入MetPA在線(xiàn)分析軟件中進(jìn)行代謝通路分析；通過(guò)代謝通路分析后所得影響值，判斷代謝通路在代謝網(wǎng)絡(luò)中是否具有重要影響。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于GC-MS聯(lián)用技術(shù)的辛芍組方抗腦缺血再灌注損傷的代謝組學(xué)研究方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述的模型組、假手術(shù)組和辛芍組的具體的處理方法為：模型組和辛芍組采用改良的Longa方法成功制備中腦動(dòng)脈栓塞大鼠模型，缺血1h后進(jìn)行再灌注，緩慢外拉栓線(xiàn)使其球端回至頸總動(dòng)脈內(nèi)，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈的供血，中動(dòng)脈缺血再灌注造模完成后，放回代謝籠中進(jìn)行飼養(yǎng)；假手術(shù)組除不插栓線(xiàn)外，其它步驟均和模型組一致。