[發明專利]乳腺癌PIK3CA熱點突變檢測探針引物序列組合和試劑盒

有效

• 申請號: 201710439843.5
• 申請日: 2017-06-12
• 公開（公告）號: CN109022573B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 李南南;易吉;朱師達
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了乳腺癌PIK3CA熱點突變檢測探針引物序列組合和試劑盒，檢測探針引物序列組合包括SEQ ID NO：1~4所示的引物序列，以及SEQ ID NO：5~10所示的探針序列，其中探針序列帶有熒光基團修飾。本發明基于微滴式數字PCR平臺，針對PIK3CA基因的三個突變位點進行引物和探針的設計，并經試驗驗證確定了一組乳腺癌PIK3CA熱點突變檢測探針引物序列組合，能夠有效地檢測PIK3CA基因的三個突變位點。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及乳腺癌PIK3CA熱點突變檢測探針引物序列組合和試劑盒。

背景技術

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，其發病率逐年上升，目前已成女性發病第一的惡性腫瘤。隨著對乳腺癌發生、發展過程中的分子生物學變化研究的不斷深入，以腫瘤細胞信號轉導通路為治療位點的靶向治療成為繼化療和內分泌治療后的又一種有效的乳腺癌治療手段。

磷脂酰肌醇-3-激酶催化單位(phosphatidylinositol-3-kinase catalyticalpha，PIK3CA)是由Volinia在1994年利用原位雜交技術檢測到的，其定位于3q26.3，長34kb，包含21個外顯子，編碼1068個氨基酸，該組氨基酸產生一長124kD的蛋白。PIK3CA的突變約4/5發生在螺旋區(外顯子9)和激酶區(外顯子20)這兩個熱點區域。其突變集中于3個熱點即E542K、E545K和H1047R。其中E542K、E545K定位于外顯子9的螺旋區而H1047R定位于外顯子20的激酶區。

PIK3CA基因突變是除HER2基因突變、P53基因突變之外乳腺癌常見的突變基因之一，其在乳腺癌中的突變率約為8％～40％。PIK3CA基因突變通過PI3K/AKT途徑引發AKT持續活化，導致成纖維細胞和乳腺上皮細胞的生長和轉化，抑制細胞凋亡，與乳腺癌的發生、發展關系密切。因此，準確檢測出PIK3CA的基因突變是急需的。

目前用于基因檢測的手段主要有基因測序、基因分型技術(SNP)、基因芯片等。其中基因測序被國際公認為最標準、最準確，但成本高，通量小，更利于分析復雜且具有高度多態性的基因。基因芯片的優勢在于其自動化和高通量，由軟件自動分析結果，方便快捷，但它也容易受到多種因素影響，假陽性率高，結果重復率不高。基因分型技術具有準確、快捷及操作簡單等優點，但成本高。

數字PCR是近年來引起重視并迅速發展起來的核酸分子絕對定量技術，由于生物學研究的需要和多學科技術的交叉融合，數字PCR已經邁入第三代——微滴式數字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)時代。ddPCR技術是一種通量較高、成本較低的絕對定量技術，可作為基因檢測的初篩技術。該技術與傳統方法的檢測結果符合率高，方法一致性好，相比于目前主流的NGS，數字PCR在如下方面優勢突出：操作快速、簡便，無需復雜的生物信息學分析，檢測靈敏度高。該技術基于單分子PCR方法來進行計數，主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，對微滴的熒光信號逐個分析統計。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度，不再依賴ct值或內參基因即可確定低至單拷貝待檢靶分子的絕對數目。

發明內容

本發明提供一種乳腺癌PIK3CA熱點突變檢測探針引物序列組合和試劑盒，能夠對乳腺癌PIK3CA熱點突變進行數字PCR擴增檢測。

根據第一方面，一種實施例中提供一組乳腺癌PIK3CA熱點突變檢測探針引物序列組合，包括如下引物序列：

PIK3CA545K(E542K)-F8：GGAAAATGACAAAGAACAGC(SEQ ID NO：1)；

PIK3CA545K(E542K)-R8：TACCTGTGACTCCATAGAAA(SEQ ID NO：2)；