[發(fā)明專利]一種植物質(zhì)體表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710436614.8
• 申請(qǐng)日: 2017-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN107267538B
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張江;武玉永;李圣純;有利利;吳夢(mèng)婷;常玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/82
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種植物質(zhì)體表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，通過合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行多元件表達(dá)盒的構(gòu)建，運(yùn)用無酶克隆技術(shù)把多個(gè)構(gòu)件一步法克隆到大腸桿菌中，加快質(zhì)體表達(dá)或轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建的速度，并通過基因槍法把DNA定點(diǎn)導(dǎo)入到質(zhì)體基因組中，并成功表達(dá)；將多個(gè)基因表達(dá)盒簡(jiǎn)單有效地組裝到一個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中，構(gòu)成多基因或多表達(dá)盒結(jié)構(gòu)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，為質(zhì)體基因工程研究和應(yīng)用提供有效的工具；所述植物質(zhì)體表達(dá)載體的構(gòu)建方法具體包括以下步驟：

步驟一、gfp表達(dá)盒組裝：gfp表達(dá)盒是由來源于煙草rRNA操縱子的啟動(dòng)子Prrn和來源于T7噬菌體的T7G10序列組成的強(qiáng)啟動(dòng)子、來源于水母Aequorea victoria中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白的變異GFP基因和來源于大腸桿菌rrnB終止子序列組成，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)把這3個(gè)片段設(shè)計(jì)組合在一起通過基因合成gfp表達(dá)盒，gfp表達(dá)盒序列見序列表，如SEQID NO:1所示；

步驟二、aadA表達(dá)盒組裝：aadA表達(dá)盒是由來源于萊茵衣藻的psbA基因的啟動(dòng)子PpsbA、來源于細(xì)菌的aadA基因和來源于萊茵衣藻的rbcL基因終止子序列和兩端同向的loxp序列組成，如SEQ ID NO:2所示；

步驟三、質(zhì)體同源片段克隆：由質(zhì)體基因組psaB基因的部分序列、rps14基因序列和trnfM基因序列組成的質(zhì)體左同源片段，由質(zhì)體基因組psbZ基因序列trnfM基因序列組成的質(zhì)體右同源片段，質(zhì)體轉(zhuǎn)化的插入位點(diǎn)為trnfM和trnG之間的非編碼區(qū)，左同源序列和右同源序列見序列表，如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；

步驟四、大腸桿菌表達(dá)載體骨架的克隆：為去多克隆位點(diǎn)MCS的質(zhì)粒pBluescript IIsk(+)序列，大腸桿菌表達(dá)載體骨架序列見序列表，如SEQ ID NO:5所示 ；

步驟五、構(gòu)建植物質(zhì)體表達(dá)載體：把合成的gfp表達(dá)盒、合成生物學(xué)合成的aadA表達(dá)盒、質(zhì)體左同源片段、質(zhì)體右同源片段和大腸桿菌轉(zhuǎn)化載體骨架這5個(gè)片段通過利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)一步法克隆到大腸桿菌Xl10-gold宿主菌中，在感受態(tài)細(xì)胞效率在2*10⁸個(gè)/μg時(shí)，能到19個(gè)的陽性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后均正確；利用計(jì)算機(jī) 輔助設(shè)計(jì)把合成生物學(xué)技術(shù)合成的gfp表達(dá)盒、利用合成生物學(xué)合成的aadA表達(dá)盒、質(zhì)體左同源片段、質(zhì)體右同源片段和大腸桿菌轉(zhuǎn)化載體骨架這5個(gè)片段合理地組合在一起；

設(shè)計(jì)一對(duì)引物P5

5'GAGAAGCAAATACAACGGGTACGCTAATCACCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG 3'帶有30bp的左同源序列和P6 5'TAATAACCCCTAAAGAAGCTAGAGCAAGGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCG 3'，帶有30bp的右同源序列， 以質(zhì)粒pBluescript II sk(+)為模板，通過PCR擴(kuò)增去除多克隆位點(diǎn)MCS的質(zhì)粒pBluescript II sk(+)得到片段，命名為片段1；

設(shè)計(jì)引物P7

5'GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCCTTGCTCTAGCTTCTTTAGGGG 3'帶有30bp的質(zhì)粒pBluescript II sk(+)序列和P8 5'TCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAAACCCTAAAATAGTTTGGCAAAACAAG 3'帶有30bp的gfp表達(dá)盒序列，以煙草葉綠體基因組DNA為模板，克隆左同源序列，命名為片段2；

設(shè)計(jì)引物P9

5'TTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACTAGTAATTAATTCCCGCCTTTCGC 3'帶有30bp的aadA表達(dá)盒序列和P10 5'TTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTGATTAGCGTACCCGTTGTATTTGC3'帶有30bp的質(zhì)粒pBluescript II sk(+)序列，以煙草葉綠體基因組DNA為模板，克隆右同源序列，命名為片段3；

以基因合成的aadA表達(dá)盒序列為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P11 5' CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGAAAAGTGAGCTATTAACGCGTCC 3'帶有30bp的gfp表達(dá)盒序列和P12 5'AAAGCGAAAGGCGGGAATTAATTACTAGTATAACTTCGTATAATGTATGC TATACGAAG 3'帶有30bp的右同源序列，通過PCR擴(kuò)增得到片段，命名為片段4；

以基因合成的GFP基因表達(dá)盒序列為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P13 5'CATCTTGTTTTGCCAAACTATTTTAGGGTTTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGC 3'帶有30bp的右同源序列和P14 5'ATAGGACGCGTTAATAGCTCACTTTTCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG 3'帶有30bp的aadA表達(dá)盒序列， 通過PCR擴(kuò)增得到片段，命名為片段5；

5個(gè)片段通過無酶克隆的方法克隆到大腸桿菌Xl10-gold中，5個(gè)片段按1:2:2:2:2的比例混勻，然后加入50微升的大腸桿菌Xl10-gold感受態(tài)細(xì)胞中，最后涂布相應(yīng)的抗生素平板。

2.權(quán)利要求1所述的植物質(zhì)體表達(dá)載體在DNA導(dǎo)入質(zhì)體過程中的應(yīng)用。