[發明專利]一種與巴貝蟲病患血清特異性結合的多肽片段及其應用

有效

• 申請號: 201710436040.4
• 申請日: 2017-06-12
• 公開（公告）號: CN109021089B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 程訓佳;滿素勤;付永鋒
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K14/44
• 分類號: C07K14/44;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬生物醫學及臨床應用技術領域，涉及一種與巴貝蟲病患血清特異性結合的多肽片段及其氨基酸序列，本發明通過對巴貝蟲裂殖子表面蛋白BMSA的結構與抗原表位分析得到一系列多肽片段，通過多肽合成制備多肽片段，可用于制備巴貝蟲病的血清學免疫診斷試劑，本發明能克服巴貝蟲病診斷中血涂片蟲體漏檢與誤診，明顯有宜于提高巴貝蟲病診斷的特異性和敏感性。

技術領域

本發明涉及生物醫學及臨床應用技術領域，具體涉一種與巴貝蟲病患血清特異性結合的多肽片段及其氨基酸序列及其應用。

背景技術

現有技術公開了巴貝蟲病(Babesiosis)是由寄生于紅細胞內的原蟲—-巴貝蟲感染引起的新發人獸共患病。研究顯示，該疾患主要由節肢動物蜱叮咬宿主后通過吸血傳播，也可以通過輸血和母嬰傳播。臨床實踐顯示，感染巴貝蟲后，根據宿主自身的免疫狀態和蟲種的不同，可表現為無癥狀、瘧疾樣癥狀和兇險性癥狀；免疫健全者感染巴貝蟲一般癥狀為疲憊、發熱、頭痛、寒戰、盜汗、貧血、食欲不振、肌痛、關節痛等；而嚴重癥狀則包括黃疸、血紅蛋白尿、脾腫大、腎功能衰竭等，多數發生于免疫缺陷病人，如老年人、HIV感染者、脾切除病人和癌癥患者等。

目前，對于巴貝蟲病的診斷檢測中，最經典的方法為顯微鏡觀察姬姆薩染色的血涂片或骨髓涂片，以發現紅細胞內寄生的蟲體為診斷依據。該方法是巴貝蟲病診斷的金標準，但該方法存在操作復雜、費時、費力，容易漏檢，而且對鏡檢人員和設備的要求較高等缺陷；核酸檢測通常采用聚合酶鏈式反應(PCR)和實時定量PCR(real-time PCR)技術對血液中巴貝蟲DNA進行檢測，具有高特異性和高敏感性，但操作復雜成本高并對實驗人員和設備要求高；免疫學檢測可用于巴貝蟲病血清學診斷，該方法具有成本低廉、檢測速度快、適用于快速高通量的篩查診斷。最近的研究顯示巴貝蟲的蟲體表面蛋白可以用于巴貝蟲病的血清學檢測，其中裂殖子表面蛋白BMSA是具有應用前景的診斷標識抗原之一。

BMSA是田鼠巴貝蟲裂殖子表面的一種抗原，分子大小為43kDa，免疫電鏡證明了BMSA蛋白定位于裂殖子表面，且向蟲體寄生的紅細胞內分泌和膜轉移。研究顯示BMSA可激活宿主免疫力，誘導出保護性免疫反應，抑制田鼠巴貝蟲對紅細胞的入侵；同時，巴貝蟲病患血清可以特異性識別全長BMSA。有研究顯示BMSA可作為診斷抗原，以膠體金、ELSIA等免疫學方法檢測患者血清中的特異性抗體用于巴貝蟲病的診斷。目前，BMSA制備采用蟲體純化及大腸桿菌重組表達，制備工藝復雜，成本高，且活性不穩定；此外，全長BMSA蛋白中部分氨基酸序列已被證實不含有被病人血清識別的抗原表位，所以以全長BMSA蛋白作為血清診斷抗原容易出現交叉反應。

基于現有技術的現狀，本申請的發明人擬提供一種與巴貝蟲病患血清特異性結合的多肽片段，僅含有巴貝蟲病患者血清的識別抗原表位的BMSA肽段片段不僅可以提高特異性和敏感性，而且由于分子量減小，僅通過化學合成方法可大量制備，具有生產簡單，活性穩定等特點，適宜應用于臨床診斷用。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中巴貝蟲病的診斷方案的不足，提供具有與患者血清特異性結合的多肽片段及氨基酸序列，進一步用于制備巴貝蟲病血清診斷制劑。

本發明所述的具有與患者血清特異性結合的多肽片段及氨基酸序列是對田鼠巴貝蟲裂殖子表面蛋白BMSA的結構分析及抗原表位的篩選得到，通過多肽合成所制備。

本發明提供了能與巴貝蟲病患者血清特異性結合的多肽片段及氨基酸序列，然而產生本發明的氨基酸序列的方法不受特別的限制。

所述的與巴貝蟲病患者血清特異性結合的氨基酸序列，含有序列1所示的氨基酸序列。

本發明通過對田鼠巴貝蟲裂殖子表面BMSA的結構與抗原表位分析得到一系列多肽片段，經過多肽合成通過ELISA等方法驗證篩選到1個與巴貝蟲感染小鼠血清及巴貝蟲患者血清都能特異性結合的多肽片段，命名為KF-25，其氨基酸序列如序列1所示。

本發明的實施中，制備純化多肽片段的方法不受特別的限制，但首選方法是多肽合成。