[發明專利]浙江道地性貝母的鑒定方法

在審

• 申請號: 201710435646.6
• 申請日: 2017-06-11
• 公開（公告）號: CN107142319A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 陳紹寧;呂洪飛;梁宗鎖;郭萬理;楊東風;胡秀芳;丁先鋒;賈巧君
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種應用高分辨率熔解曲線技術鑒定浙貝母道地性的方法。

背景技術

浙貝母為百合科植物浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鱗莖。貝母類藥材首載于《神農本草經》，清代《本草綱目拾遺》將貝母明確分為川貝和浙貝，《中國藥典》中收錄有浙貝母、川貝母、湖北貝母、平貝母和伊貝母，臨床用藥使用較多的是浙貝母和川貝母2大類群。不同貝母化學成分復雜，藥理作用也存在顯著差異。浙貝母以浙江產區道地貝母為主，包括長江流域地區產出的湖北貝母、東陽貝母等。浙貝母主要包含浙貝甲素和浙貝乙素2中含量較高的生物堿，具有清熱化痰、止咳、開郁散結的功效。川貝以四川產出的川貝母為主，包括西北和東北產出的伊貝母和平貝母等，均含有同一類含量較高的生物堿-西貝素，具有清熱潤肺的功效。在實際應用中幾種貝母常易混淆。

傳統鑒別中藥材的方法難以精準區分貝母與其混偽品。DNA條形碼技術在2003年被首次提出，并且迅速在物種的分類與鑒定研究領域中得到廣泛的關注和應用。它是一種新型物種分子鑒定技術。該技術可以利用短的、標準的DNA序列片段作為物種標記，定位親緣關系，分析分支來源，為中藥材提供快速、精準的鑒定。它彌補了傳統鑒定方法的缺陷，并具有自身獨特的優勢，例如準確性高、穩定性好、操作簡便等。

由于核基因ITS2具有很強的物種水平鑒定能力和良好的PCR擴增效率，因此適合作為植物DNA條形碼的序列。ITS2區域可以潛在地用作標準DNA條形碼識別藥用植物及其近緣種，并且可以作為一個新的通用條碼來更廣泛地識別植物類群。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種快速精準鑒定道地性浙貝母的檢測方法，本發明采用高分辨率熔解曲線分析技術檢測ITS2序列，分析熔解曲線特征及差異能夠有效準確地鑒定浙江貝母道地性。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種快速精準鑒定道地性浙貝母的檢測方法，包括DNA提取，還包括以下步驟：

一、設置參數：

1)、PCR擴增

PCR擴增體系為：

擴增體系中所用的ITS2的引物序列：

引物F(ITS2-F)：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；

引物R(ITS3-R)：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。

PCR擴增程序為：

95℃變性5min；

95℃變性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40個循環；引物退火溫度為55～59℃(最佳退火溫度為57℃)；

Green-2-Go Master mix，即為Green-2-Go qPCR Mastermix-Low ROX(2x)；

2)、將擴增產物直接進行HRM(即，上述40個循環后進入HRM程序)：

HRM程序為：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降溫至25℃；

收集65-95℃的熒光信號數據；

二、將浙貝母標準品(浙江道地性貝母)和待測樣品分別按照步驟一所述參數進行HRM；

以浙貝母標準品(浙江道地性貝母)為參照做基線，待測樣品與基線所產生的相對熒光值的差值為縱坐標生成派生熔解曲線，從而獲得高分辨率熔解曲線差異圖；

當待測樣品與基線所產生的相對熒光值的差值為-5.418～6.582之間，判定是浙貝母；

反之，則判定為非浙貝母。

作為本發明的浙江道地性貝母的鑒定方法的改進：高分辨率熔解曲線分析，是在RocheLightCyclerTM 480Ⅱ熒光定量PCR儀器上進行HRM。所采用的軟件為LightCycler 480Ⅱ分析軟件。

當熔解曲線聚于基線，與基線差異值在-5.418～6.582之間，判定是浙貝母。其他產地貝母偏離基線正向高于24.582或負向低于-11.418，并在不同Tm值處出現偏離峰。川貝母在Tm值89.75℃時出現正向的偏離峰，湖北貝母在Tm值91.5℃時出現負向的偏離峰。

在本發明中，所用數據分析方法為HRM差異圖分型法，直接對熔解曲線進行比較，通過軟件歸一化后，以熒光信號的差值建立標準模型。

作為本發明技術方案的改進：本發明利用磁珠法深加工產品基因組DNA抽提試劑盒提取貝母藥材干粉的DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及濃度測定。所得DNA濃度為20.47～77.34ng/μl。