[發(fā)明專利]一種快速準(zhǔn)確篩選產(chǎn)漆酶真菌的有效方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710434845.5
• 申請(qǐng)日: 2017-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN107236673A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祝嫦巍;黃守程;汪雁;馬玉涵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽科技學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)漆酶真菌的篩選方法，具體的是一種快速?gòu)沫h(huán)境中篩選產(chǎn)漆酶真菌的有效方法。

背景技術(shù)

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，在真菌中普遍存在。漆酶因其底物范圍很寬而被廣泛應(yīng)用于紙漿漂白、

染料脫色、有機(jī)物合成、木質(zhì)素降解等工業(yè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。由于不同應(yīng)用領(lǐng)域要求不同酶學(xué)性質(zhì)的漆酶，因此通過(guò)開發(fā)新的漆酶基因資源來(lái)獲得具有多樣性的漆酶意義重大。漆酶真菌具有基因多樣性的特點(diǎn)為我們廣泛篩選產(chǎn)漆酶真菌提供了無(wú)限的可能。傳統(tǒng)的篩選產(chǎn)漆酶真菌都是采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行篩選，利用愈創(chuàng)木酚與漆酶發(fā)生變色反應(yīng)篩選產(chǎn)漆酶真菌，具體做法是采集到的樣品用無(wú)菌水分別稀釋成不同梯度后涂布接種于愈創(chuàng)木酚-PDA 平板上，恒溫培養(yǎng)，然后挑選能使愈創(chuàng)木酚發(fā)生褐變的菌株，進(jìn)一步劃線、分離、純化。此方法雖然為通用方法，但操作起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率不高；此外，愈創(chuàng)木酚法的靈敏度不高，即如果真菌的產(chǎn)漆酶量很低，顯色反應(yīng)不明顯。因此，尋找一種快速靈敏的篩選產(chǎn)漆酶真菌的有效方法，對(duì)提高科研人員的研究效率具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明專利目的是為解決科學(xué)研究中快速有效篩選產(chǎn)漆酶真菌提供一個(gè)新型的方法，解決目前科學(xué)研究過(guò)程中采用常規(guī)方法篩選產(chǎn)漆酶真菌效率和靈敏度不高的問(wèn)題。

本發(fā)明專利通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：在培養(yǎng)皿中配置PDA培養(yǎng)基，其中加入適量的2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，即ABTS，使得ABTS的終濃度在0.01~0.03%之間。

將植物材料（如枯枝、落葉、樹皮、作物秸稈、植物根部等）剪成合適的小片段，長(zhǎng)度不超過(guò)培養(yǎng)皿的直徑；然后將剪碎的植物器官小片段放在上述配置的培養(yǎng)基中，37攝氏度恒溫培養(yǎng)1~48小時(shí)。若植物器官小片段周圍的培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色或者紫色反應(yīng)，則表明此處有產(chǎn)漆酶真菌。

從有顏色反應(yīng)處的培養(yǎng)基上挑選真菌菌絲，繼續(xù)培養(yǎng)即可純化。

采用上述設(shè)計(jì)方案的效果：通過(guò)以上方案的實(shí)施，能夠快速靈敏的篩選出產(chǎn)漆酶真菌，且陽(yáng)性率為100%。

附圖說(shuō)明

圖1展示的是采用本發(fā)明專利方法篩選產(chǎn)漆酶真菌的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1：首先配置含0.01% ABTS的PDA培養(yǎng)基，然后采集的枯枝剪成長(zhǎng)約2cm的小片段，挑選6根放置于配好的培養(yǎng)基上，1小時(shí)后發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)枯枝小片段旁邊的培養(yǎng)基出現(xiàn)紫色反應(yīng)。37攝氏度恒溫培養(yǎng)12小時(shí)后切取菌絲體純化培養(yǎng)，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，均屬于產(chǎn)漆酶真菌。

實(shí)施例2：配置含0.015% ABTS的PDA培養(yǎng)基，然后采集的樹皮剪成長(zhǎng)寬約1.5cm的小塊，挑選4片放置于配好的培養(yǎng)基上，37攝氏度恒溫培養(yǎng)18小時(shí)后發(fā)現(xiàn)4片樹皮小塊旁邊的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色反應(yīng)。切取菌絲體純化培養(yǎng)，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，均屬于產(chǎn)漆酶真菌。

實(shí)施例3：配置含0.028% ABTS的PDA培養(yǎng)基，然后采集的水稻秸稈剪成長(zhǎng)約3cm的小片段，挑選8根放置于配好的培養(yǎng)基上，37攝氏度恒溫培養(yǎng)35小時(shí)后發(fā)現(xiàn)其中3根水稻秸稈旁邊的培養(yǎng)基出現(xiàn)紫色反應(yīng)。切取菌絲體純化培養(yǎng)，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，均屬于產(chǎn)漆酶真菌。

實(shí)施效果：采用上述方案篩選產(chǎn)漆酶真菌，無(wú)需事先對(duì)材料進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，只需要將剪碎的植物材料放在含有ABTS的培養(yǎng)基上，一旦出現(xiàn)綠色或者紫色反應(yīng)，即可百分之百認(rèn)定該菌是產(chǎn)漆酶真菌。因此，篩選的靈敏度和效率都大大的提高了。