[發明專利]一種高效快速分離T?DNA插入位點側翼序列的方法及其用途

在審

• 申請號: 201710434000.6
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN107190003A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 凌飛;崔瑩
• 申請（專利權）人: 武漢天問生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 劉奇

1.一種高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取農桿菌介導的轉基因植株的基因組DNA；

2)將基因組DNA片段化，DNA修復、加A和連接后，利用磁珠進行片段選擇后進行文庫構建，構建的文庫與T-DNA邊界序列進行雜交捕獲以后進行PCR富集；

3)對文庫進行高通量測序，對測序數據進行生物信息學分析，獲取T-DNA插入位點。

2.根據權利要求1所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟1)中提取基因組DNA的方法為CTAB法。

3.根據權利要求1所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟2)中基因組DNA片段化的方法為超聲破碎法。

4.根據權利要求3所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟2)中DNA片段大小為300bp～500bp。

5.根據權利要求1所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟2)中DNA修復、加A和連接的方法分別為將DNA雙鏈的片段修復成平末端，并且將5’末端磷酸化；加A：在末端修復后的3’末端加一個腺苷酸；連接：與接頭進行連接。

6.根據權利要求1所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟2)中使用探針進行雜交捕獲。

7.根據權利要求6所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述探針為SEQ ID NO 1所示序列。

8.根據權利要求1所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟2)中PCR富集的循環數為15～20個循環。

9.根據權利要求1所述的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述步驟3)中測序數據進行生物信息學分析為原始序列經NGS QC Toolkit進行質量控制，獲得高質量clean reads，對clean reads采用DNA測序處理，以T-DNA邊界序列為參考基因組，提取一端匹配到T-DNA，另一端未匹配的reads序列。后者序列以水稻基因組序列，采用blast軟件進行比對分析，根據比對結果設計引物進行后續驗證。

10.根據權利要求9所述的的高效快速分離T-DNA插入位點側翼序列的方法，其特征在于，所述T-DNA邊界序列為SEQ ID NO 2所示序列。