[發明專利]利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法及其制品

有效

• 申請號: 201710433440.X
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN107261132B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 嚴悌昆;張毓金;黃淑芬
• 申請（專利權）人: 廣州漁躍生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61K9/19;A61P31/22;C12N5/071;C12N5/02;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.用細胞生長液培養制苗用細胞，待細胞密度達1.0×l0⁶?1.5×l0⁶個/mL，接種到含有15?20g/L微載體的無菌生物反應器內培養；

S2.待所述步驟S1制苗用細胞培養4?5天，密度達到1.2×l0⁶?1.5×l0⁶個/mL接種豬偽狂犬病病毒弱毒株，將反應器溫度調至36℃?38℃，并加入細胞維持液進行繁殖培養；

S3.在所述步驟S2得到的細胞培養液中加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空干燥得到豬偽狂犬病活疫苗；

所述步驟S1中制苗用細胞由無血清添加的細胞生長液培養得到，所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其含量組成：DMEM基礎培養液80?90% v/v，賴氨酸1.0?1.5g/L，甘氨酸0.5?1.0g/L，苯異亮氨酸0.75?1.5g/L，精氨酸1.5?2.0g/L，蘇氨酸0.5?1.0g/L，纈氨酸0.5?1.5g/L，枸櫞酸10?15mg/L，尾加壓素II 0.35?0.75mg/L，苦丁冬青甙H 0.15?0.5g/L，轉鐵蛋白3?8g/mL，5-羥色胺0.1?2.5mg/L，EDTA 5?7mg/L，檸檬酸鐵1.5?3.5mg/L，皮質醇0.5?0.75mg/L，成纖維因子0.1?0.5mg/L，細胞纖維連結蛋白1.5?2.5mg/L；

所述步驟S2中細胞維持液由以下成分及其重量份組成：DMEM基礎培養液85?92% v/v，賴氨酸1.0?1.5g/L，甘氨酸0.5?1.0g/L，苯異亮氨酸0.75?1.5g/L，精氨酸1.5?2.0g/L，蘇氨酸0.5?1.0g/L，纈氨酸0.5?1.5g/L，枸櫞酸10?15mg/L，尾加壓素II 0.35?0.75mg/L，淫羊藿苷0.2?0.5g/L，轉鐵蛋白3?8g/mL，EDTA 5~7mg/L，檸檬酸鐵1.5?3.5mg/L，皮質醇0.1?0.5mg/L，細胞纖維連結蛋白1.5?2.5mg/L；所述步驟S3穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4%w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5% w/v、L-谷氨酸1% w/v、腐胺2.75% w/v、蔗糖3.5% w/v和檸檬酸鈉5% w/v。

2.根據權利要求1所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，制苗用細胞為Vero細胞，豬偽狂犬病病毒弱毒株為Bartha-K61弱毒株。

3.根據權利要求1所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其重量份組成：DMEM基礎培養液88% v/v，賴氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯異亮氨酸1.35g/L，精氨酸1.65g/L，蘇氨酸0.83g/L，纈氨酸1.20g/L，枸櫞酸12.5mg/L，尾加壓素II 0.55mg/L，苦丁冬青甙H 0.45g/L，轉鐵蛋白6.75g/mL，5-羥色胺0.68mg/L，EDTA6.5mg/L，檸檬酸鐵2.45mg/L，皮質醇0.60mg/L，成纖維因子0.35mg/L，細胞纖維連結蛋白1.75mg/L。

4.根據權利要求1或2所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述生物反應器為TideCe11固定床微載體生物反應器。

5.根據權利要求1或2所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟S2中細胞維持液由以下成分及其重量份組成：DMEM基礎培養液90% v/v，賴氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯異亮氨酸1.25g/L，精氨酸1.85g/L，蘇氨酸0.65g/L，纈氨酸1.35g/L，枸櫞酸12.5mg/L，尾加壓素II 0.50mg/L，淫羊藿苷0.35g/L，轉鐵蛋白6.5g/mL，EDTA 6.5mg/L，檸檬酸鐵2.5mg/L，皮質醇0.25mg/L，細胞纖維連結蛋白2.25mg/L。