[發明專利]用于純化重組ADAMTS13和其它蛋白質的方法以及其組合物

在審

• 申請號: 201710433159.6
• 申請日: 2010-08-02
• 公開（公告）號: CN107267490A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: M·哈斯拉赫爾;A·米特雷爾;C·菲德勒;C·邁爾
• 申請（專利權）人: 百深有限責任公司;百深公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 上海華誠知識產權代理有限公司31300
• 代理人: 王金英

1.一種用于將具有1型凝血酶敏感蛋白基序的重組解整合素樣金屬肽酶13(ADAMTS13)蛋白質從包含ADAMTS13蛋白質和非ADAMTS13雜質的樣品中純化的方法，所述方法包括兩個串聯的色譜步驟：

第一步包括：在使得所述ADAMTS13蛋白質出現于由羥基磷灰石所得的流過餾分中的條件下，用色譜法使所述樣品與所述羥基磷灰石接觸，其中所述ADAMTS13蛋白質不與羥基磷灰石結合，而所述非ADAMTS13雜質得以保留在所述羥基磷灰石上；和

第二步包括：隨后用色譜法使所述流過餾分與結合ADAMTS13蛋白質的混合模式陽離子交換/疏水性相互作用樹脂接觸；和

用洗脫緩沖液將所述ADAMTS13蛋白質從混合模式陽離子交換/疏水性相互作用樹脂上洗脫。

2.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括在用色譜法與所述羥基磷灰石接觸之前，用色譜法使所述樣品與陰離子交換樹脂接觸并將所述ADAMTS13蛋白質從所述陰離子交換樹脂上洗脫。

3.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括在用色譜法與所述羥基磷灰石接觸之前，通過超濾來濃縮所述樣品中的所述ADAMTS13蛋白質；和通過滲濾交換到包含鈣離子和鋅離子的緩沖液中來使所述ADAMTS13蛋白質穩定。

4.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括在與所述羥基磷灰石或所述混合模式陽離子交換/疏水性相互作用樹脂接觸之后，通過降低緩沖液電導率來制備所述ADAMTS13蛋白質以便進行陽離子交換的制備步驟。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述制備步驟是通過超濾/滲濾來進行。

6.根據權利要求4所述的方法，其中所述制備步驟是通過滲析來進行，所述滲析由通過單個滲析模塊的不超過2次操作組成。

7.根據權利要求4所述的方法，其中所述制備步驟是通過凝膠過濾來進行。

8.根據權利要求1或4所述的方法，其進一步包括使所述ADAMTS13蛋白質進行至少一個病毒滅活或病毒清除步驟。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述病毒滅活步驟包括向所述ADAMTS13蛋白質添加包含非離子型清潔劑和有機溶劑的溶劑-清潔劑混合物，

所述溶劑-清潔劑混合物是適用于使脂質包膜病毒滅活的溶劑-清潔劑混合物。

10.根據權利要求9所述的方法，其中在用溶劑-清潔劑混合物處理所述ADAMTS13蛋白質之前，將所述ADAMTS13蛋白質固定于載體上，

所述載體選自下組：樹脂、載玻片、珠粒、基質或膜。

11.根據權利要求10所述的方法，其中將所述ADAMTS13蛋白質固定于陽離子交換樹脂上；或所述ADAMTS13蛋白質通過載體上的基團和蛋白質上的基團之間的鍵而被固定。

12.根據權利要求9所述的方法，其中所述溶劑-清潔劑混合物包含1％TRITONX-100、0.3％磷酸三正丁酯和0.3％吐溫80。

13.根據權利要求8所述的方法，其中所述病毒清除步驟包括用納濾器過濾所述ADAMTS13蛋白質以清除病毒和/或病毒顆粒。

14.根據權利要求4所述的方法，進一步包括使所述ADAMTS13蛋白質進行至少一個病毒滅活或病毒清除步驟，其中所述病毒滅活或病毒清除步驟在所述制備步驟之后進行。

15.根據權利要求11所述的方法，其進一步包括使用梯度洗脫將所述ADAMTS13蛋白質從所述陽離子交換樹脂上洗脫，所述梯度洗脫包括使用具有低鹽含量的第一緩沖液和具有較高鹽含量的第二緩沖液。

16.根據權利要求11所述的方法，其進一步包括使用分步洗脫將所述ADAMTS13蛋白質從所述陽離子交換樹脂上洗脫。

17.根據權利要求16所述的方法，其中所述分步洗脫包括使用存儲緩沖液將所述ADAMTS13蛋白質從所述陽離子交換樹脂上洗脫，

其中所述存儲緩沖液包含300mM NaCl、2mM CaCl₂、20mM組氨酸、0.05％吐溫80，pH為7.5。

18.根據權利要求17所述的方法，其中沒有后續的濃縮或緩沖液更換步驟。