[發明專利]一種高效誘導泥鰍同源四倍體魚苗的方法

在審

• 申請號: 201710432156.0
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN107182858A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 周小云;馮兵
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A01K61/10
• 分類號: A01K61/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 龔瑩瑩

技術領域

本發明屬于細胞工程育種技術領域，具體公開了一種高效誘導泥鰍同源四倍體魚苗的方法。

背景技術

同源四倍體，是指體細胞中含有四套相同來源染色體組的個體，通常是由二倍體生物染色體加倍產生。人工誘導魚類同源四倍體在水產動物育種研究中具有重要的意義，一方面，能育的人工四倍體魚與普通二倍體魚交配，可得到大量的可供養殖生產的三倍體后代，解決了人工誘導三倍體在生產規模上的局限性、誘導效率不穩定和胚胎死亡率高等問題，是規?；a三倍體魚的最佳方法；另一方面，人工合成的同源四倍體，由于確切的知道其起源祖先，并且，與二倍體相比，DNA序列沒有差異，實現了倍性系列的配套，可以準確地反應多倍體形成早期基因變化與基因組變異特點，為研究生物進化過程中染色體組復制的作用及基因的表達方式提供了良好的模式系統。因此，同源四倍體魚的誘導一直是染色體組工程育種中備受關注的問題。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)以其豐富的營養價值和特有的滋補藥用功效而被譽為“水中人參”，深受中國、日本及韓國等地消費者的青睞。近年來，泥鰍的市場需求量日益增加，市場價格節節攀升，泥鰍養殖已經成為水產養殖者的新寵，泥鰍新品種的培育對泥鰍產業的發展具有重要的意義。泥鰍四倍體在自然界中早已存在，但有研究發現，這些天然四倍體泥鰍是由二倍體泥鰍祖先通過種間雜交產生，并且已經發生了二倍化，因此，真正具有遺傳功能的同源四倍體泥鰍只能通過人工誘導獲得。

關于泥鰍同源四倍體的誘導，目前尚未見文獻報道，但在其近緣種大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)中，Nam等(2001)曾有過報道，他們采用熱休克法誘導出了少量的四倍體個體，隨后常重杰&杜啟艷(2002)采用同樣的方法也獲得了部分四倍體個體。然而，在實際操作中，研究人員發現，由于胚胎個體間發育速度不同，同源四倍體魚的誘導誘導條件(如，處理起始時間、休克溫度和處理持續時間等)難以掌握，四倍體的出現率和存活率非常低下(常重杰&杜啟艷，2002)，并且誘導效果不穩定、結果的可重復性很差。迄今為止，同源四倍體的人工誘導僅在虹鱒中獲得成功并應用于生產，在泥鰍等其它魚類中尚未獲得兩性能育并形成群體的四倍體魚，這嚴重阻礙了泥鰍等魚類新品種的開發。

本發明中，我們開辟了一種新的、高效誘導同源四倍體泥鰍的方法，使用該方法誘導同源四倍體泥鰍，誘導效率遠高于目前的誘導方法，并且效果穩定、結果的可重復性強，在泥鰍多倍體育種、以及與多倍化相關的遺傳學研究等方面有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效誘導泥鰍同源四倍體魚苗的方法，本方法簡便易行，可誘導出批量的同源四倍體魚苗，誘導效率較傳統的方法有顯著的提高，并且誘導結果穩定。

為了實現上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種高效誘導泥鰍同源四倍體魚苗發方法，包括下述步驟：將野生二倍體泥鰍的卵子與精子按常規方式授精后，將受精卵置于40.5±0.5℃水浴中熱休克處理2-3min，隨后迅速轉移至1.5±0.5℃冰水中冷休克處理30-60min，受精卵復溫，然后繼續孵化至出苗。

以上所述的方案中，優選的，按照下述步驟進行：

25℃條件下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精，28min后，將受精卵置于40.5℃水浴中熱休克處理2min，隨后迅速轉移至1.5℃冰水中冷休克處理45min，受精卵復溫，然后繼續孵化至出苗。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

本發明提供的誘導泥鰍同源四倍體泥鰍的方法，操作簡便、方法高效。利用本發明所述方法，同源四倍體泥鰍魚苗的產率可達10.4±0.3％，遠高于目前的誘導方法，并且效果穩定、可重復性強。本發明為同源四倍體泥鰍苗種的生產提供了高效的技術手段，在泥鰍多倍體育種、以及與多倍化相關的遺傳學研究等方面具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為不同誘導方法下泥鰍魚苗的早期存活率、四倍體泥鰍的出現率和四倍體泥鰍的產率。

熱休克(40.5℃)指的是：25℃下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精28min后，將受精卵置于40.5℃水浴中，分別熱休克處理1min、2min和3min，共3組實驗；

冷休克(1.5℃)指得是：25℃下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精28min后，將受精卵置于1.5℃水浴中，分別冷休克處理30min、45min和60min，共3組實驗；