[發明專利]一種原代豬肝細胞的分離及培養方法在審
| 申請號： | 201710431644.X | 申請日： | 2017-06-09 |
| 公開（公告）號： | CN109022348A | 公開（公告）日： | 2018-12-18 |
| 發明（設計）人： | 不公告發明人 | 申請（專利權）人： | 江蘇齊氏生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 214434 江蘇省無錫市江陰市東*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 豬肝細胞 恒流泵 預熱的 細胞 灌注 中國實驗小型豬 混合酶溶液 完全培養基 戊巴比妥鈉 禁食 腹腔注射 混合酶液 靜脈插管 染色檢測 篩網過濾 無菌條件 細胞活性 細胞濾液 細胞形態 緩沖液 培養瓶 實驗豬 振蕩 包被 腹面 腹腔 肝素 剪碎 重懸 錐蟲 切開 成活率 接種 麻醉 消化 檢測 | ||
1.一種原代豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)選取3~4周齡，體重2.5~4 kg的雄性中國實驗小型豬，術前12 h禁食禁水，腹腔注射戊巴比妥鈉和肝素；(2)將實驗豬麻醉后腹面向上固定于板上，無菌條件下切開腹腔；(3)靜脈插管，用恒流泵灌注預熱的HBSS緩沖液；(4)用恒流泵灌注預熱的GBSS混合酶溶液；(5)剪碎組織用GBSS混合酶液振蕩消化，篩網過濾，離心，棄上清；(6)取細胞濾液用錐蟲藍染色檢測細胞活性；(7)細胞計數后用完全培養基重懸接種到包被后的培養瓶，置于37 ℃、5% CO2環境中培養；(8)細胞形態鑒定；(9)ELISA法檢測；(10)RT-PCR檢測。
2.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(1)所用戊巴比妥鈉濃度為30 mg/kg體重，肝素100 U/kg體重。
3.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(3)所用HBSS緩沖液含1%~5%的BSA，PH為7.2~7.4。
4.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(3)所用恒流泵的灌注速度為速度為25~50 ml/min，灌注時間5~20 min，灌注量800~1000 ml。
5.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(4)和(5)所用GBSS混合酶液（PH為7.2~7.4）含0.1%~0.5% Ⅳ型膠原酶和0.002%~0.006% DNaseⅠ。
6.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(4)所用恒流泵的灌注速度為5~10 ml/min，灌注時間15~30 min，灌注量100~300 ml。
7.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(6)所述振蕩消化時間5~15 min，80~200目篩網過濾。
8.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(7)所述的完全培養基為含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素的雙抗、4~6 μg/ml胰島素的H-DMEM培養基，pH為7.4。
9.根據權利要求1所述的豬肝細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(8)所述的培養瓶用3~4 μg/cm2的多聚賴氨酸包被，培養條件為37 ℃、5% CO2培養箱。
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