[發明專利]一種人間充質干細胞外泌體凍干粉的制備方法、使用方法有效
| 申請號： | 201710431084.8 | 申請日： | 2017-06-08 |
| 公開（公告）號： | CN107245472B | 公開（公告）日： | 2021-08-06 |
| 發明（設計）人： | 黃兵;殷勤偉 | 申請（專利權）人： | 北京智能寶生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775;A61K9/19;A61K35/28;A61P17/00 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 100107 北京市朝陽區天朗*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 人間 干細胞 外泌體凍 干粉 制備 方法 使用方法 | ||
1.一種人間充質干細胞外泌體凍干粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)人間充質干細胞的培養、純化及傳代；
2)誘導人間充質干細胞大量合成和分泌有功能的外泌體；
3)超濾濃縮人間充質干細胞外泌體，制得濃縮培養液并進行冷藏；
4)將冷藏后的所述濃縮培養液制備成凍干粉，向所述凍干粉中添加復合液進行保存；
步驟2)的具體操作方法：選擇增殖能力強的第3～5代人間充質干細胞，置于含氧量為21％的37℃培養箱中，用含有5％FBS的DMEM/F12培養基進行培養，直到細胞匯合度為60～70％時，改用促進外泌體合成和分泌的培養條件進行培養3～5天，后收集上清液；
所述促進外泌體合成和分泌的培養條件：無血清的饑餓培養基，同時向所述饑餓培養基中添加促進因子，且所述饑餓培養基中含氧量為1％～5％，pH值為6.5～7；
所述促進因子為：1-100ng/ml伽馬干擾素，1-10mg/ml多聚賴氨酸，1-6ng/ml MG-CSF，2-5ng/ml IL-6,1-5ng/ml HGF,1-10mM ATP，14mg/dl鈣離子；
所述饑餓培養基包含細胞因子、維生素C、化學小分子，其中各組分的含量如下，
所述饑餓培養基還包括增加了ITS添加劑的DMEM/F12基礎培養基，所述ITS為胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉培養基添加劑，所述基礎培養基的配制方法：將DMEM和F12按溶液體積比1:1的比例混合均勻后，再添加1％ITS而成；
步驟1)中人間充質干細胞的培養采用無血清培養基，所述無血清培養基包含細胞因子、維生素C、化學小分子，其中各組分的含量如下，
所述無血清培養基還包括增加了ITS添加劑的DMEM/F12基礎培養基，所述ITS為胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉培養基添加劑，所述基礎培養基的配制方法：將DMEM和F12按溶液體積比1:1的比例混合均勻后，再添加1％ITS而成。
2.如權利要求1所述的一種人間充質干細胞外泌體凍干粉的制備方法，其特征在于，
步驟3)中濃縮方法：采用離心機對步驟2)的產物進行離心，去除細胞碎片以及細菌后，過濾，將濾液進行超濾離心，制得濃縮液，向所述濃縮液中添加賦形劑并置于-80℃進行冷藏。
3.如權利要求2所述的一種人間充質干細胞外泌體凍干粉的制備方法，其特征在于，
所述賦形劑為甘露醇，添加量為每100ml濃縮液中添加甘露醇5g。
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