[發明專利]一種綠膿桿菌外毒素A的高效液相色譜檢測方法

有效

• 申請號: 201710429741.5
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN106990188B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 張琪;蔡德富
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾醫學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 11690 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 張丹<國際申請>=<國際公布>=<進入國

1.一種利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取綠膿桿菌發酵液和甲醇進行混合浸泡，再加入NaOH溶液，置于搖床上振搖提取，離心得到含有綠膿桿菌外毒素A的上清液，取上清過濾，獲得樣品溶液；

(2)使用HPLC法測定，流動相為甲醇、乙腈和水；起始流動相中甲醇、乙腈和水的體積比為10：15：75，洗脫3-5分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為30：35：35，洗脫10-15分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為30：40：30，洗脫5-10分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為35：45：20，洗脫3-5分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比調整為10：15：75，洗脫3-5分鐘；

其中，所述的HPLC法中分離色譜柱選自TC-C18色譜柱、HypersilBDS、HypersilODS、LiChrosorb、SHIMADZUVP-ODS、Inertsil ODS-SP、Extend-C18、ZORBAXODS、ZORBAXSB-C18、LiChrosorbC18、HypersilODS中的一種；

色譜條件為：柱溫為30-40℃；流動相的流速為0.3-1.5ml/min；波長為200-220nm；進樣量10μl；柱長為150mm，柱內徑為5μm。

2.如權利要求1所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：所述的分離色譜柱為TC-C18色譜柱。

3.如權利要求1-2任一項所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：所述的色譜條件為柱溫為35℃。

4.如權利要求3所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：流動相的流速為1ml/min。

5.如權利要求1、2、4任一項所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：波長為210nm。

6.如權利要求1所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：步驟(2)為：使用HPLC法測定，流動相為甲醇、乙腈和水；起始流動相中甲醇、乙腈和水的體積比為10：15：75，洗脫5分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為30：35：35，洗脫15分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為30：40：30，洗脫10分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為35：45：20，洗脫5分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比調整為10：15：75，洗脫5分鐘。

7.如權利要求1所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：步驟(2)為：使用HPLC法測定，流動相為甲醇、乙腈和水；起始流動相中甲醇、乙腈和水的體積比為10：15：75，洗脫3分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為30：35：35，洗脫10分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為30：40：30，洗脫5分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比連續性調整為35：45：20，洗脫3分鐘；之后甲醇、乙腈和水的體積比調整為10：15：75，洗脫3分鐘。

8.如權利要求1所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：使用的HPLC的流動相中還含有有機酸。

9.如權利要求8所述的利用HPLC法檢測綠膿桿菌外毒素A的方法，其特征在于：所述有機酸為甲酸、乙酸或丁酸中的一種或多種。