[發(fā)明專利]一種數(shù)字PCR微滴制備方法

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• 申請日: 2017-06-08
• 公開（公告）號: CN107099456A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮繼宏;張森;高辛未;張碩晨
• 申請（專利權(quán)）人: 北京工業(yè)大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/68;B01L3/00
• 代理公司: 北京思海天達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11203
• 代理人: 張立改

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種數(shù)字PCR微滴制備裝置及制備方法，屬于數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù):

PCR技術(shù)是現(xiàn)代生物學最重要的工具之一，它廣泛應用在醫(yī)學診斷、個體化醫(yī)療、食品檢驗、轉(zhuǎn)基因生物檢測、病原體鑒定、免疫分析、法醫(yī)科學等方面。而作為PCR技術(shù)的最新一代，基于微流控技術(shù)發(fā)展產(chǎn)生的數(shù)字PCR，具有比傳統(tǒng)qPCR更小的反應體積、更快的反應速度、更低的系統(tǒng)噪聲和更高的靈敏度。

通過油包水結(jié)構(gòu)，將單個DNA分子封裝到單獨的微滴中，利用油的惰性實現(xiàn)DNA分子間的相互隔離，每個DNA分子被限制在自己的微滴中單獨的進行擴增，避免來自其他序列競爭。在合適的溫度條件下完成DNA分子的擴增后，通過記錄微滴的總體個數(shù)和可以檢測到熒光信號的微滴個數(shù)，利用泊松分布算法就可以實現(xiàn)對DNA拷貝數(shù)的精確定量。

作為數(shù)字PCR技術(shù)的核心，微滴的制備一直是限制其發(fā)展的重要因素。由于數(shù)字PCR是通過泊松分布計算事件概率得到最終結(jié)果，為了保證結(jié)果的準確性，微滴的制備應該滿足兩個基本條件：1.高數(shù)據(jù)群體的體量2.優(yōu)秀的單分散性。正是由于這兩個條件的制約，嚴重限制了數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展。近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的最佳契機。

本發(fā)明涉及一種數(shù)字PCR的微滴制備裝置及制備方法，滿足微滴制備微滴產(chǎn)率高、體積小、單分散性高的系統(tǒng)要求。雖然單分子PCR微流控液滴的利用仍處于早期階段，但其巨大的應用前景已經(jīng)被證實，也將為生物醫(yī)學工程在單分子放大分析等領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)提供全新的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容：

為了解決數(shù)字PCR微滴生成過程中產(chǎn)率低、體積大、單分散性差等關(guān)鍵技術(shù)難題，使微滴生成更加簡便，本發(fā)明提供了一種數(shù)字PCR微滴制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)來實現(xiàn)的：

一種適用于數(shù)字PCR微滴生成的微流控裝置，其特征在于，包括油相微通道(7)、水相微通道(3)、出口通道(5)、油相入口(1)、水相入口(2)、擴張角(8)；油相微通道(7)整體為長方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的微通道，長方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一邊A邊的中間位置與水相入口(2)連通，與長方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一邊A邊相對的一邊B邊的中間位置與水相微通道(3)直接連接連通，同時出口通道(5)在長方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的B邊中間位置也與油相微通道(7)連通；油相微通道(7)通過擴張角與出口通道(5)連接連通，出口通道(5)與出口(6)連通；油相微通道(7)、水相微通道(3)、擴張角(8)相連通處形成通道交叉(4)；在通道交叉(4)處，水相微通道(3)與油相微通道(7)連通的一段是直管，直管且垂直于油相微通道(7)的B邊；在通道交叉(4)處，水相微通道(3)和油相微通道(7)的連通口a與擴張角(8)與和油相微通道(7)的連通口b相對；連通口b的直徑與連通口a的直徑相等；

水相微通道(3)為蛇形結(jié)構(gòu)；油相微通道(7)的直徑等于水相微通道(3)的直徑；優(yōu)選出口通道(5)的直徑是油相微通道(7)直徑的2-10倍；進一步優(yōu)選油相微通道(7)的直徑和水相微通道(3)的直徑為80-120μm；出口通道(5)的直徑為200-300μm。進一步優(yōu)選擴張角(8)的角度為120-150°。

上述數(shù)字PCR微滴的制備裝置制備PCR微滴的方法，其特征在于，載體油從油相入口(1)進入油相微通道(7)后在A邊進行分流，分別流入兩側(cè)的微通道，由于兩側(cè)的微通道直徑相同，保證得到載體油的流速相同，減少微滴生成過程中由于流速變化造成的微滴大小不均勻；反應液從水相入口(2)進入后需經(jīng)過水相微通道(3)后，從油相入口流入的載體油和從水相入口(2)流入的反應液會在通道交叉(4)處匯合，由于載體油縱向的剪切力和橫向的粘性拉力生成微滴，然后進入出口通道(5)。

水相微通道(3)采用蛇形結(jié)構(gòu)微通道的作用是減少外界干擾引起的反應液流速的瞬時改變，造成微滴生成不均勻，具有穩(wěn)流作用，同時減小入口流速變化對微滴生成單分散性的影響，影響后續(xù)的檢測結(jié)果。

微流控裝置的設(shè)計主要針對數(shù)字PCR微滴生成這一特定問題，所述微通道包括水相入口通道、設(shè)置在水相入口通道后的蛇形穩(wěn)流通道、油相入口通道、設(shè)置在油相入口通道后的分流通道、出口為錐形放大的油相與水相交匯通道以及微滴生成后的輸出通道。

與油相入口通道相連的分流通道可以將油相平均分流到上下兩個通道，保證兩個通道內(nèi)油相流速的一致性。

各通道通過連接器與外界相連。