[發明專利]一種C?肽免疫抗原和抗C?肽多克隆抗體及其制備與應用

在審

• 申請號: 201710429079.3
• 申請日: 2017-06-08
• 公開（公告）號: CN107176998A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 趙肅清;呂瑞;盧業玉;鐘文穎;夏娜娜
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K16/26;C07K16/06;G01N33/74
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種C-肽免疫抗原和抗C-肽多克隆抗體及其制備與應用。

背景技術

C肽是含31個氨基酸的多肽，它和胰島素的A、B鏈組成胰島素原，是A、B鏈的連接鏈，在胰島素原分子的折疊，二硫鍵的正確配對中起重要作用。C肽由胰島素原裂解產生，一分子胰島素原合成一分子C肽與一分子的A、B鏈，后二者合成胰島素。C肽與胰島素共同存在于同一顆粒囊內最終以等分子分泌。C肽不通過肝酶代謝，而主要經過腎臟清除，其清除速率慢，半衰期為20min，明顯較長，其基礎水平平均值為0.4nml/l，當人進食葡萄糖后1h升至1.68nmol/l，反映早期的胰島素功能，3h降至0.65nmol/l。故檢測人血清中的C-肽，能準確測定血循環中C肽水平，能反映β細胞合成與釋放胰島素功能。

糖尿病是一組由胰島素分泌絕對或相對不足所導致的以慢性高血糖為特征的代謝綜合征。最新研究顯示，該疾病在中國成年人群中，約有9240萬例病例，占總人口數的9.7％，此外，另有1482萬成年人具有前驅糖尿病癥狀，約占總人口數的1.55％。目前臨床診斷篩查中，血清C肽水平對糖尿病的分型診斷、治療方案選擇和療效監測具有重要的臨床參考意義，是篩查診斷糖尿病患者主要的常規必檢項目，此外，對于胰島素瘤的診斷亦有重要參考價值。

發明內容

為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的在于提供一種C-肽免疫抗原的制備方法，該制備方法以C-肽作為原料偶聯載體蛋白多聚賴氨酸(PLL)制得C-肽免疫抗原。

本發明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的C-肽免疫抗原。

本發明的再一目的在于提供一種抗C-肽多克隆抗體，該抗C-肽多克隆抗體利用上述C-肽免疫抗原制備。

本發明的第四個目的在于提供上述C-肽免疫抗原和抗C-肽多克隆抗體的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種C-肽免疫抗原的制備方法，包含如下步驟：

(1)8分支MAP核心結構七聚賴氨酸樹脂的合成：將王樹脂和賴氨酸混合進行偶聯合成，得到8分支MAP核心結構七聚賴氨酸樹脂；

(2)樹脂裂解和去保護：將步驟(1)制得的8分支MAP核心結構七聚賴氨酸樹脂與裂解試劑混合，然后攪拌反應；反應后將反應液過濾，收集濾液，濃縮，濃縮物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚賴氨酸水溶液；

(3)七聚賴氨酸的分離與純化：采用高效反相液相色譜儀對步驟(2)制得的七聚賴氨酸水溶液進行分離，檢測280nm吸收值，收集主峰析出液，濃縮，干燥，得到七聚賴氨酸；

(4)將步驟(3)制得的七聚賴氨酸與MBS(3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯)混合，攪拌反應，得到MBS活化的七聚賴氨酸；將C-肽與MBS活化的七聚賴氨酸混合，攪拌反應，得到C-肽免疫抗原粗品；

(5)在-15～-20℃鹽水浴，氮氣保護下，將甲基嗎啡啉和氯甲酸異丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中，反應5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃鹽水浴，氮氣保護下，繼續反應1～1.5h，得到反應產物1；然后將反應產物1從鹽水浴中取出，室溫繼續反應15～30min，得到反應產物2；在反應產物2中加入水和乙酸乙酯進行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入質量分數為10％的碳酸氫鈉溶液進行萃取，將Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水進行萃取，將殘留的碳酸氫鈉洗出；加入無水硫酸鈉，除去乙酸乙酯相中殘留水分；除去無水硫酸鈉，乙酸乙酯相濃縮，加入2倍Fmoc-Cys-OH質量的硅膠，混勻，并干燥；

(6)將步驟(5)制得的產物裝柱，步驟(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS緩沖液，然后使用中壓過柱，采用PBS緩沖液為洗脫劑，收集含目標峰的流份；將得到的流份與等體積的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物與4-甲基-3-硝基苯胺反應，產物用PBS緩沖液洗滌；洗滌后的產物在365nm紫外光下照射30～60min，得到C-肽免疫抗原；

步驟(1)中所述的王樹脂和賴基酸的摩爾比優選為1∶7；

步驟(1)中所述的偶聯合成的具體操作優選為：以DCM溶漲樹脂，然后按照去保護、活化、偶聯步驟，在ABI 431多肽合成儀上依次連接第1級到第3級賴氨酸；

步驟(2)中所述的裂解試劑優選包含如下組分：TFA 900mL/L、苯甲硫醚50mL/L、二巰基乙烷30mL/L、苯甲醚20mL/L；

步驟(2)中所述的攪拌反應的時間優選為2h；

步驟(2)中所述的濃縮優選為低壓旋轉濃縮；