[發(fā)明專利]一種基于單細(xì)胞芯片技術(shù)的抗體篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710428415.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN107219351A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊威;王笑非;毛明;汪巨峰;王茜莎;韓重;肖百全;郭健敏;黃遠(yuǎn)鏗;王俐梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省生物資源應(yīng)用研究所
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;C07K16/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于單細(xì)胞芯片技術(shù)的抗體篩選方法。

背景技術(shù)

近年來，抗體新藥在惡性腫瘤、自身免疫病等重大疾病的治療中顯示了良好的療效，國際國內(nèi)對(duì)抗體類藥物的開發(fā)成為新熱點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)也異常激烈。在抗體新藥的開發(fā)過程中，需要建立和應(yīng)用多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，包括抗體篩選和功能確認(rèn)、細(xì)胞株構(gòu)建和工藝開發(fā)、中試工藝放大和臨床前研究等多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。目前，國內(nèi)在抗體篩選和工藝開發(fā)方面，存在很多技術(shù)難點(diǎn)，如目前大多數(shù)采用的通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的抗體篩選方法有很多弊端，無法實(shí)現(xiàn)大通量篩選，無法同時(shí)獲取上萬抗體的序列和親和力數(shù)據(jù)等，導(dǎo)致獲取最優(yōu)化的抗體序列的概率較低。因此，建立一種可實(shí)現(xiàn)大通量篩選，能同時(shí)獲取上萬抗體的序列和親和力數(shù)據(jù)的抗體篩選方法是抗體新藥開發(fā)的必然需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于單細(xì)胞芯片技術(shù)的抗體篩選方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于單細(xì)胞芯片技術(shù)的抗體篩選方法，包括以下步驟：

步驟1）表達(dá)特異表面抗原的細(xì)胞免疫小鼠，抽取小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行ELISA分析；

步驟2）根據(jù)其結(jié)果將單細(xì)胞附著在細(xì)胞芯片上，與熒光標(biāo)記的抗原結(jié)合，獲得陽性克隆信息和抗體親和力信息；

步驟3）符合標(biāo)準(zhǔn)的抗體經(jīng)在位基因擴(kuò)增，獲取抗體可變區(qū)序列。

其中優(yōu)選地，所述步驟2）的抗原為雄特異性抗原（serologically detected H-Y antigens）。

其中優(yōu)選地，所述步驟2）的抗體是H-Y噬菌體抗體。

相對(duì)上述背景技術(shù)，本發(fā)明所提供的方法能快速獲得大量的抗體的序列和親和力數(shù)據(jù)，本發(fā)所述的篩選方法能為制藥研究領(lǐng)域提供很好的基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的核心是提供一種基于單細(xì)胞芯片技術(shù)的抗體篩選方法。為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 : 8 周齡SPF級(jí)C57BL /6小鼠 ，雄鼠10只，體重為16-20g，由廣州市賽柏諾生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)小鼠在光照 12 h /d、22-25℃環(huán)境溫度條件下飼養(yǎng)，自由飲水、采食，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則飼養(yǎng)。

主要試劑與儀器:重組缺陷型大腸桿菌菌株XL1-Blue的基因型為recAl、endAl、gyrA96、thi-1、hsdR17、supE44、relA1、lac［F＇proAB，lac1qZΔM15Tn10(Tetγ)］、輔助噬菌體VCSM13、HRP-羊抗M13購自Stratagene公司。pComb3載體是噬菌體表面Fab段表達(dá)載體，含氨芐青霉素(Amp)的抗性基因，載體大小為4029bp，由美國Scipps研究所惠贈(zèng)。XbaI和XhoI購自MBI公司。顯微照相系統(tǒng)(Motic，Moticam350)，倒置顯微鏡(Leica，DMIL)，酶標(biāo)儀(上海熱電公司，Multiskan MK3)。

實(shí)施例1

一種基于單細(xì)胞芯片技術(shù)的抗體篩選方法，包括以下步驟：

步驟1）表達(dá)特異表面抗原的細(xì)胞免疫小鼠，抽取小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行ELISA分析；

脾臟細(xì)胞懸液100μL(5×106個(gè)/mL)為抗原，取10μLPEG沉淀的噬菌體抗體，用3%BSA/PBS補(bǔ)充至100μL，同時(shí)設(shè)PBS空白、VCSM13陰性對(duì)照，HRP-羊抗M13(用3%BSA/PBS稀釋4000倍)為二抗，以A值＞陰性對(duì)照A值2倍以上作為陽性克隆判定標(biāo)準(zhǔn)。顯色后于倒置顯微鏡下觀察，拍照。

步驟2）

根據(jù)其結(jié)果將單細(xì)胞附著在細(xì)胞芯片上，與熒光標(biāo)記的雄特異性抗原（serologically detected H-Y antigens）結(jié)合，獲得陽性克隆信息和抗體親和力信息；

步驟3）符合標(biāo)準(zhǔn)的抗體（H-Y噬菌體抗體）經(jīng)在位基因擴(kuò)增，獲取抗體可變區(qū)序列。