[發明專利]可參與生物合成轉化后修飾的葡糖基轉移酶基因

有效

• 申請號: 201710425714.0
• 申請日: 2017-06-08
• 公開（公告）號: CN107345232B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 徐玉泉;張禮文;謝李楠;王辰;王曉婧
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12P19/00;C12P17/06
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

本發明發現了一種葡糖基轉移酶，可用于黃酮類和聚酮類化合物的糖基化修飾，從而實現化合物的定向生物轉化，獲得有別于這些天然產物結構的新型活性化合物。

技術領域：

本發明涉及一個可參與黃酮類，聚酮類化合物合成后修飾的糖基化酶基因及其在生物轉化和合成生物學中的應用。

背景技術：

真菌生物轉化是利用細胞內特定的酶對外源化合物進行結構修飾與改造，從而獲得更有價值的代謝反應。白僵菌屬真菌通過各種代謝方式轉化不同結構類型的化合物，在要藥物研究領域占有重要地位。球孢白僵菌中含有大量的糖基轉移酶、細胞色素P450、脫氫酶、脫羧酶和酰基轉移酶等修飾酶基因，具有多種轉化功能，其中最獨特功能為糖基化作用，目前已經被用于300多種不同底物的生物轉化。

糖基轉移酶(GT)在生物體內催化活化的糖連接到不同的受體分子，糖基化的產物具有很多生物學功能。在不同的GT家族中存在一類與抗生素生物合成相關的GT，它的功能是在抗生素等生物活性物質的生物合成后期使其糖基化，通過糖的位置、類型和數量的改變對抗生素的活性進行調節。目前，我們在實驗室篩選的球孢白僵菌中發現了此家族中的葡糖基轉移酶，通過異源表達可修飾黃酮醇，黃烷醇、二氫黃酮、異黃酮類和查爾酮在內的黃酮類及其衍生化合物、苯二酚內酯等聚酮類化合物，表現出高效的催化效率以及廣泛的底物識別能力。這一點使其在組合生物合成中能得到靈活的應用，為先導化合物的發現及藥物的定向轉化提供了新的研究方法與途徑。

目前雖然已發現球孢白僵菌對天然產物具有生物轉化的功能，但還未發現任何參與天然產物合成后修飾的相關基因，只能利用菌體進行生物法轉化，轉化效率低，產物不單一，無法實現定向轉化。球孢白僵菌的生物轉化以糖基化為為主，發現球孢白僵菌中參與合成后修飾的糖基轉移酶有利于拓展活性化合物的化學空間，提高化合物結構的多樣性，為發現和改造新活性的天然產物奠定基礎。

發明內容:

本發明的目的是，獲得可參與化合物生物轉化的葡糖基轉移酶基因，利用該基因實現某些化合物體外的糖基化修飾，增強其活性。

本發明通過人工合成，獲得了葡糖基轉移酶基因，命名為BbUGT86，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

構建了可在酵母BJ5464中表達的重組質粒，并在酵母中進行異源表達轉化。

將所得的蛋白產物分別與不同的聚酮類或黃酮類化合物進行作用，得到了原化合物結構中連接有葡萄糖基的糖基化產物。

通過一系列的生理生化實驗，發現這些原先極性較低而不適于藥用的化合物在糖基化修飾之后較未修飾前水溶性增強，有利于改善其油水分配系數。

具體如下：

1、獲得BbUGT86基因

通過基因組測序和相關預測軟件對糖基轉移酶進行結構分析，設計引物，由cDNA擴增獲得一種新的葡糖基轉移酶基因BbUGT86，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、葡糖基轉移酶BbUGT86酵母表達載體構建與酵母轉化

將含有完整的BbUGT86的DNA片段連接到PRS425m載體上，構建了組成型表達質粒PRS425m-BbUGT86，轉入營養缺陷型酵母受體BJ5464中進行異源表達。

3、重組子的篩選

將表達載體PRS425m-BbUGT86轉入不能合成亮氨酸缺失的酵母菌中，利用亮氨酸營養缺陷型標記篩選重組子。

4、聚酮類化合物飼喂轉化試驗及轉化產物分析

在上述重組菌株培養過程中，添加化合物1進行作用。然后用有機溶劑提取，將提取物進行HPLC液相、二級質譜和核磁共振分析，確證產物結構。所述化合物1是苯二酚內酯類聚酮(Desmethyl-Lasiodiplodin)。