[發明專利]一種臍帶間充質干細胞凍存液及其使用方法

在審

• 申請號: 201710423232.1
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107006453A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 李志遠;楊雅評;鄧思浩;湯沙;嚴波;王利群;郭海江
• 申請（專利權）人: 湖南惠益森細胞基因工程有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細胞生物學、生物醫學技術領域，具體涉及一種臍帶間充質干細胞凍存液及其使用方法。

背景技術

臍帶是連于胚胎臍部與胎盤間的索狀結構，外覆羊膜，內含靜脈，臍動脈和來自中胚層的膠樣粘液性結締組織即沃頓氏膠。大量研究證實臍帶沃頓氏膠中富含豐富的間充質干細胞。

臍帶間充質干細胞(MSCs)具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化。它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、內皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應用前景；具有較強的免疫調節作用，可用于治療紅斑狼瘡和硬皮病等自身免疫性疾病，降低細胞或器官移植后的免疫排斥反應，提高細胞或器官移植的成功率；能促進造血恢復功能，與單一造血干細胞移植比較，間充質干細胞和造血干細胞共移植能顯著提高白血病和難治性貧血等疾病的治療效果；能修復損傷或病變的組織器官，用于治療骨和肌肉衰退性疾病、心腦血管疾病、肝病、腦及脊髓神經損傷和老年癡呆等。

細胞凍存在不加保護條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水會形成冰晶，能導致細胞內發生一系列的變化，如機械損傷、電解質濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH值改變、蛋白質變性等，能引起細胞死亡。但如向培養基中加入保護劑(甘油或DMSO)，可使冰點降低，在緩慢的凍存條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外。儲存在-130度以下低溫中能加水冰晶的形成。溶解細胞時，速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-5～0攝氏度后，細胞仍能生長，活力不受任何損害。當前使用的保護劑為DMSO和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，使用濃度范圍在5～10％之間，常用10％。

為保護細胞最大存活率，通常用細胞培養基作為溶劑，除二甲基亞砜外，還添加各種細胞保護及營養物質，以提高細胞活率；為獲得來源方便的臍帶間充質干細胞，提高細胞活率，開展有效的干細胞移植及建立干細胞庫，改進干細胞凍存復蘇技術，為建立一種長期低溫保存干細胞的方法的研究和應用具有重大意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種臍帶間充質干細胞凍存液及其使用方法，使用本發明提供的細胞凍存液長時間凍存后的細胞復蘇活率較高。

一種臍帶間充質干細胞凍存液，是在DMEM/F-12培養基中含有

所述的臍帶間充質干細胞凍存液，優選地是在DMEM/F-12培養基中含有

所述的臍帶間充質干細胞凍存液的使用方法，是取培養12-15d生長良好的細胞瓶，將培養液倒入離心管中，做為終止液，然后用胰酶消化5min使細胞懸浮，再加入終止液終止消化，離心后棄去上清，再加入生理鹽水洗滌后，再次離心，得到所述的臍帶間充質干細胞凍存液凍存獲得的細胞，按凍存細胞數所需濃度為2×10⁷個細胞/ml凍存液，定量加入預冷的所述的神經干細胞凍存液，充分混勻后，將此細胞懸液轉移至凍存管中，每管1ml，封口，標記凍存日期，放于程序降溫盒中；分級冷凍細胞：4℃，40min；-20℃，30min；-80℃，過夜；次日緩降至液氮表面直至投入液氮保存。

上述的臍帶間充質干細胞凍存液的使用方法，是使用的胰酶濃度為0.125％含EDTA的胰酶37℃消化5min。

本發明采用Ultroser^TMG血清替代物代替胎牛血清作為細胞的營養來源，Ultroser^TMG包含6類真核生物細胞生長所必須的營養物質，包括粘附因子，結合蛋白，生長因子，微量礦物元素，荷爾蒙，維生素等；與胎牛血清相比，它的生物活性是胎牛血清的5倍，營養成分更為豐富，提高間充質干細胞凍存復蘇率，使用濃度低，節約了成本；而右旋糖酐-40可以很好的維持滲透壓，在溫度下降過程中，仍能維持良好的滲透壓環境，避免了細胞因溫度下降，滲透壓改變而出現細胞死亡的現象，從而提高了間充質干細胞凍存復蘇率。

附圖說明

圖1為使用不同臍帶間充質干細胞凍存液凍存的細胞復蘇后細胞的生長狀態。

圖2為使用本發明臍帶間充質干細胞凍存液凍存的細胞復蘇后的流式細胞檢測結果。

具體實施方式

以下結合具體實施方式旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。

1)臍帶間充質干細胞凍存液的配制：

10ml間充質干細胞凍存液中含有以下組分：

堿性成纖維細胞生長因子bFGF(母液濃度為50ug/ml)10ul(終濃度50ng/ml)，