[發明專利]一種甘草次酸的制備方法

在審

• 申請號: 201710422980.8
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107058443A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 季浩;閆成亮;于燕燕;闞建偉;竇長清;孔繁博;徐娟
• 申請（專利權）人: 江蘇天晟藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙)32274
• 代理人: 王云

1.一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1配制基礎液體培養基：所述的基礎液體培養基的組成為：蒸餾水 + 土豆 + 蔗糖 + 鏈霉素；

S2接種：向發酵罐中的基礎液體培養基中加入甘草酸，至基礎液體培養基的pH值為5-6，同時將種子液接種到發酵罐中，種子液的接種體積為基礎液體培養基體積的1.5-2.5%，并于20-30℃的溫度條件下培養65-75h，得到發酵液；

S3提取：將步驟S2得到的發酵液，利用微波破壁5-8min，微波功率500W，然后過濾，再向濾液中加入0.5-1倍濾液體積的乙酸乙酯，同樣條件提取3次，合并提取液后經50℃真空旋轉蒸干，得甘草次酸粗品；

S4脫色：將步驟S3得到的甘草次酸粗品溶解到乙醇溶液中，甘草次酸粗品與乙醇溶液的料液比為：1g：（1-2）ml，然后向溶解液中加入活性炭脫色，活性炭的加入質量為甘草次酸粗品質量的6-8%，然后過濾后，濾液在20-25℃的條件下進行重結晶6-8h，再次過濾后，將結晶體在48-52℃的溫度條件下烘干7-9h，得到甘草次酸成品。

2.根據權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，S1步驟中，所述的基礎液體培養基的具體配置過程為：

首先向發酵罐中加入蒸餾水，然后加入去皮切塊的土豆，土豆和蒸餾水的料液比為：1g ：5ml，煮沸30min，然后用4~6層紗布過濾，濾液中加入蔗糖，蔗糖與蒸餾水原始用量的料液比為：1g：50ml，再加蒸餾水定容至原始體積，并于121℃滅菌30min，當溫度降至50℃時加入鏈霉素，鏈霉素與蒸餾水的料液比為：0.05mg：1ml。

3.根據權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，S2步驟中，所述的種子液的制備方法為：將菌株從冰箱取出，室溫放置0.5-1h，然后于無菌條件下接種于裝有種子液培養基的250m L錐形瓶中，錐形瓶中種子液培養基的裝樣量為40%，置于30℃恒溫振蕩器中培養，轉速為120r·min^-1，監測菌液OD600nm，當發酵液的OD600nm為0.3-0.5時，即得種子液。

4.根據權利要求3所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，所述的菌株為自主誘導培養，編號為TSP-C-15，具體培養過程為：

（1）制備初篩菌液：取甘草酸，置于錐形瓶中，加蒸餾水，所述甘草酸和蒸餾水的料液比為：1g：20ml，置于20-25℃的陰涼處放置培養，每日輕搖錐形瓶兩次，每4h一次，隨時觀察菌的生長情況，20天后得初篩菌液；

（2）將初篩菌液接種到初篩固體培養基上，置于30℃恒溫培養箱中培養72h；

（3）從初篩固體培養基中挑取長勢較好的單菌落，用“三段劃線法”進行分離純化后，再將分離純化的菌株接種于斜面的初篩固體培養基中，進行編號，然后置于4℃冷藏保存，備用；

（4）在無菌條件下，將初篩所得菌株分別接種到復篩液體培養基中，于 30℃恒溫振蕩器中發酵培養；

（5）于2、4、8、14、24h后，分別取樣檢測甘草次酸含量，最終選出（甘草酸轉化為甘草次酸的轉化率高于50%）適合工業生產的菌株TSP-C-15。

5.根據權利要求4所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，所述的初篩固體培養基的具體配置過程為：

200mL蒸餾水中加入20.00g去皮切塊的土豆，煮沸30min，然后用4~6層紗布過濾，濾液中加入4.00g蔗糖，3.60g瓊脂，加蒸餾水定容至200mL，121℃滅菌30min，當溫度降至50℃加入2.00g滅菌的甘草酸充分混合后得到初篩固體培養基。

6.根據權利要求4所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，所述的復篩固體培養基為基礎液體培養基。

7.根據權利要求3所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，所述的種子液培養基的具體配置過程為：

首先向發酵罐中加入蒸餾水，然后加入去皮切塊的土豆，土豆和蒸餾水的料液比為：1g ：5ml，煮沸30min，然后用4~6層紗布過濾，濾液中加入蔗糖，蔗糖與蒸餾水原始用量的料液比為：1g：50ml，再加蒸餾水定容至原始體積，并于121℃滅菌30min，當溫度降至50℃時加入鏈霉素，鏈霉素與蒸餾水的料液比為：0.05mg：1ml。

8.根據權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，S3步驟中，所述的乙醇的濃度為95%。