[發明專利]誘導性多能干細胞向造血干細胞分化的方法及其培養基

在審

• 申請號: 201710422772.8
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107338220A
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 顧春雨;魏強
• 申請（專利權）人: 北京呈諾醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789;C12N5/10
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙)11392
• 代理人: 符彥慈

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種無血清無動物源性誘導性多能干細胞向造血干細胞分化的方法及其培養基。

背景技術

臨床上普遍使用造血干細胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植，則需要進行人體的白細胞抗原配型，否則發生免疫排異會危及患者生命。現有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱，但數量供不應求，使其在疾病中的臨床應用中受到限制。誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的出現成功地繞開了免疫原性和倫理性兩個最關鍵的問題，而且來源廣泛，可以建立患者特定的iPS細胞，做到個體化治療，將為干細胞移植大規模在臨床應用提供了可能性(Sontag S,M et al.Modelling IRF8Deficient Human Hematopoiesis and Dendritic Cell Development with Engineered iPS Cells.Stem Cells.2017Apr；35(4):898-908.)。

目前,iPS定向分化為血液細胞公認的技術有兩個：①與OP9細胞共培養，②通過擬胚體(embryoid body,EB)途徑。利用OP9細胞與iPS共培養，通過模擬體內的造血微環境，支持早期的造血干細胞分化(Klump H,Teichweyde N et al.Development of patient-specific hematopoietic stem and progenitor cell grafts from pluripotent stem cells,in vitro.Curr Mol Med.2013Jun；13(5):815-20.Schrimpf C,Wrede C et al.Differentiation of induced pluripotent stem cell-derived neutrophil granulocytes from common marmoset monkey(Callithrix jacchus).Transfusion.2017Jan；57(1):60-69.)。擬胚法是指在特定的誘導條件下，多能干細胞在懸浮培養環境中分化形成的由三個胚層細胞組成的立體結構。在擬胚體形成的過程中，添加特定的細胞因子可以促進多能干細胞向中胚層分化，提高相應造血干細胞的比例。

這兩種常用的技術雖然能夠在一定程度上誘導iPS細胞向造血干細胞分化，但是這兩種誘導技術也存在著一定的缺點，主要表現在：①造血干細胞誘導體系中存在非人源成分，給誘導分化后的造血干細胞臨床應用帶來安全隱患。比如OP9細胞為小鼠骨髓基質細胞，如果用于人類造血干細胞誘導體系，存在鼠源性污染細胞的可能性。目前的人類造血干細胞分化技術涉及到胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)或者牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)等均為動物源性成分，加之FBS的成分的不確定性，都極大的限制了iPS來源的造血干細胞在臨床應用。②用擬胚體途徑誘導分化造血干細胞的技術，存在消耗iPS細胞量大，擬胚體分化階段不整齊等問題，造成造血干細胞分化效率較低(Féraud O,Valogne Y,et al.Donor Dependent Variations in Hematopoietic Differentiation among Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cell Lines.PLoS One.2016Mar 3；11(3):e0149291.)，不利于iPS向造血干細胞定向誘導分化在臨床應用上的大規模開展。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種誘導性多能干細胞向造血干細胞分化的方法及其培養基。本發明不涉及動物源性細胞和成分，大大提高了iPS細胞來源的造血干細胞的安全性，為利用患者自身的iPS細胞大規模生產臨床應用級別的造血干細胞提供了一種新的途徑和方法。

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：

誘導性多能干細胞向造血干細胞分化的方法，包括如下步驟：

S1.將誘導性多能干細胞(具體可為人源、皮膚成纖維細胞)進行預處理；預處理的目的是提高細胞的活性和分化能力；