[發明專利]一種靶向沉默Kdm7a基因的shRNA慢病毒載體構建及其應用在審
| 申請號： | 201710422006.1 | 申請日： | 2017-06-02 |
| 公開（公告）號： | CN108977465A | 公開（公告）日： | 2018-12-11 |
| 發明（設計）人： | 王寶利;劉穎;楊曉月 | 申請（專利權）人： | 天津醫科大學代謝病醫院 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P19/08;A61P19/10 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 300070*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 構建 間充質干細胞 小鼠骨髓 靶向 骨髓間充質干細胞 骨質疏松癥治療 慢病毒表達載體 成骨細胞分化 慢病毒顆粒 慢病毒載體 內源性表達 去甲基化酶 感染小鼠 基因干擾 宿主細胞 藥物研發 基因 骨缺損 慢病毒 潛在的 組蛋白 靶點 可用 轉染 細胞 感染 疾病 應用 | ||
1.一種靶向沉默Kdm7a的慢病毒干擾載體，其特征在于：所述載體中包含小鼠Kdm7a基因的小發卡RNA干擾片段的編碼序列，該序列是：
正義鏈：5’-GATCCGTACTAAGTAACTTTGAGGCTTCAAGAGAGCCTCAAAGTTACTTAGTATTTTTTACGCGTG-3’；
反義鏈：5’-AATTCACGCGTAAAAAATACTAAGTAACTTTGAGGCTCTCTTGAAGCCTCAAAGTTACTTAGTACG-3’。
2.如權利要求1所述，靶向沉默Kdm7a的慢病毒干擾載體的構建方法如下：
首先針對小鼠Kdm7a基因(ID：338523)設計小發卡RNA干擾序列(shRNA)，合成為其編碼的正義鏈和反義鏈寡核苷酸；pLVX-shRNA2質粒經限制性內切酶BamHI與EcoRI酶切，并回收線性載體片段；Kdm7a shRNA編碼序列的正義鏈和反義鏈寡核苷酸經變性退火后，將其克隆到線性的目的載體pLVX-shRNA2中，以獲得Kdm7a shRNA的慢病毒表達載體，測序驗證。
3.根據權利要求2所述，構建靶向沉默Kdm7a的慢病毒載體后，利用293T細胞包裝Kdm7a干擾慢病毒顆粒并測定慢病毒滴度。
4.根據權利要求3所述，利用Kdm7a干擾慢病毒感染小鼠骨髓間充質細胞后，誘導成骨分化，通過堿性磷酸酶染色進行形態學觀察，通過qRT-PCR檢測成骨分化相關特異性因子的mRNA表達水平的變化。
5.一種如權利要求1所述的靶向沉默Kdm7a的慢病毒載體可用于治療骨缺損和骨質疏松癥等疾病的藥物開發。
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