[發明專利]一種產芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201710419622.1
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN108998383B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 花強;韋柳靜;曹選;林嘉宇
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/88;C12N15/81;C12P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

本發明公開了一種產芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用。該基因工程菌是將來自獼猴桃(Actinidia?arguta)的芳樟醇合成酶基因LIS經優化后，轉化解脂耶氏酵母(Yarrowia?lipolytica)Po1f；在此基礎上同時過表達內源HMG1、IDI1或ERG中的一種或多種基因。此外，通過對該基因工程菌發酵時添加的碳源如葡萄糖、甘油、果糖、檸檬酸以及丙酮酸及其濃度進行選擇，進一步提高芳樟醇的產量。芳樟醇的產量最高能達到6.96mg/L，以及單位胞內芳樟醇含量939.04μg/g細胞干重(DCW)的極高產量。該基因工程菌能用于大規模商業化生產，前景良好。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地涉及一種產芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用。

背景技術

芳樟醇結構中含有兩個類異戊二烯基和十個碳原子，因其作為精油中的芳香物質和食品添加劑以及高級生物能源而被高度關注。芳樟醇作為開環單萜叔醇，是眾多精油中的主要成分之一。花香中約有70％的萜類化合物以芳樟醇為代表。芳樟醇作為芳香和風味物質被添加到洗發水、香皂、沐浴露等化妝品中和家用洗滌劑中以及加工食品和飲料中。另外，芳樟醇也是生產維生素E、微生物A、法呢醇、香茅醇和紫羅蘭酮等產物的關鍵前體。芳樟醇還具有抗真菌、細菌和殺蟲劑的特性。

當前，天然產物受到自然資源的限制產量普遍很低。作為植物的次級代謝產物，通常提取和分離都會對環境造成一定的污染并且成本很高。同時，大部分天然產物都具有幾種異構體，并且結構復雜，傳統的化學工藝合成可能無法滿足純度的要求。基于這些原因，利用微生物生產天然產物成為一個可行的選擇，其合成途徑見圖1所示。一般通過外源引入芳樟醇合成酶基因生物發酵法生產芳樟醇，但目前在釀酒酵母中引入外源芳樟醇合成酶基因，其產量不高，僅為0.095mg/L(Pegah?Amiri?et?al.,Metabolic?engineering?ofSaccharomyces?cerevisiae?for?linalool?production,Biotechnology?Letters,March2016,Volume?38,Issue?3,pp?503–508)或0.127mg/L(孫明雪等，調控釀酒酵母類異戊二烯合成途徑強化芳樟醇合成，生物工程學報，2013年6月23日，29(6)：751-759)，亟需高產芳樟醇的基因工程菌。

發明內容

本發明要解決的技術問題是為了克服現有技術中缺乏高產芳樟醇的基因工程菌的不足，提供一種產芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用。

本發明提供的技術方案如下：

本發明的技術方案之一為：一種產芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是將經特殊優化的外源獼猴桃(Actinidia?arguta)芳樟醇合成酶基因(LIS)轉化尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母構建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示；優選地，所述尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母為解脂耶氏酵母Polf。

優選地，基因工程菌還轉化了內源基因，其中內源基因包括HMG1、IDI1和/或ERG；IDI1為單拷貝、雙拷貝或三拷貝，ERG基因為ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20^F88W-N119W；HMG1、IDI1、ERG8、ERG10、ERG12及ERG19基因的核苷酸序列如基因庫中所示；ERG20^F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.2所示。

根據本發明，ERG20^F88W-N119W是指ERG20基因的突變體，其在現有ERG20基因88位氨基酸F(苯丙氨酸)變為W(色氨酸)，119位氨基酸N(天冬酰胺)變為W(色氨酸)。

更優選地，內源基因為HMG1；進一步更優選地，內源基因為組合1)HMG1和IDI1、2)HMG1和ERG、或3)HMG1、IDI1和ERG；其中ERG優選ERG12或ERG20^F88W-N119W。